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专题5,DNA和蛋白质技术,课题1,DNA的粗提取和鉴定,讨论2：如何证明他们是遗传物质？,讨论3：怎样才能将细胞内的这些物质分离出来？,讨论1：构成生物体的遗传物质是什么？,自主学习（实验思路）,1、DNA从哪提取？（用什么方法破碎细胞而DNA不受破坏）2、怎样将DNA与细胞中的其他生物大分子分离？3、怎样鉴定我们提取的DNA？,一、基础知识,（一）提取DNA的方法阅读课本54页，思考：提取生物大分子的基本思路是什么？DNA主要与哪些生物大分子分离？方法1：根据DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，提取DNA结合图，思考回答课本的问题,1、DNA在0.14molLNaCl溶液中溶解度最低而蛋白质此时的溶解度最高的特点，可以使DNA与蛋白质分离，形成沉淀析出，通过过滤，得到初提取的滤出物DNA。2、利用DNA不溶于酒精，细胞中的某些蛋白质可溶于酒精的特点，可以将DNA与蛋白质进一步分离。3、蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响4、大多数蛋白质不能忍受6080C的高温，而DNA在80C以上才会变性（蛋白质变性后溶解度降低而产生沉淀）5、洗涤剂能够瓦解细胞膜（脂质），但对DNA没有影响（在植物材料中提取DNA使用）,（二）检验原理：1、DNA遇二苯胺（沸水浴）呈蓝色2、甲基绿与DNA结合，呈绿色,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取阅读55页的实验材料,材料：新鲜的鸡血,原则上只要含DNA的生物材料都可以，但是选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。,?,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液(DNA释放和溶解）此步为实验成功以否的关键1、破碎动物细胞的方法2、破碎植物细胞的方法,渗透吸水胀破,洗涤剂+食盐搅拌研磨？不充分？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出DNA,洗涤剂离子去污剂，能溶解细胞膜，利于DNA释放食盐NaCl，利于DNA的溶解于研磨液中研磨不充分使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,（三）去除滤液中的杂质（DNA的纯化）阅读课本55页的三个方案下面以鸡血为实验材料粗提取DNA并鉴定DNA的实验过程，请观察并总结实验步骤,新鲜的鸡血鸡血细胞,离心,1、获取实验材料,柠檬酸钠溶液？,用吸管除去离心管上部的澄清液,2、破碎细胞，获取含DNA的滤液（DNA的释放）,鸡血细胞,足量的蒸馏水,玻璃棒一个方向快速充分搅拌,细胞破裂,一层纱布过滤（1）,含染色质的滤液,3、去除滤液中的杂质，获取DNA的粗提取物（DNA的纯化）,染色质滤液,2mol/LNaCl溶液,玻璃棒一个方向搅拌,析出DNA黏稠物,DNA溶解，染色质中的DNA与蛋白质分离,慢加足量蒸馏水：NaCl溶液浓度由2mol/L变0.14mol/L,DNA溶液,多层纱布过滤(2),纱布上DNA的黏稠物,2mol/LNaCl溶液,二层纱布过滤,含DNA的NaCl滤液,含DNA的NaCl滤液,冷却的无水乙醇，玻棒轻搅,乳白色DNA细丝,3、去除滤液中的杂质，获取DNA的粗提取物（DNA的纯化）,去除滤液中的杂质小结（方案一）,染色质滤液,2mol/LNaCl溶液,玻璃棒一个方向搅拌,DNA溶解，染色质中的DNA与蛋白质分离,多层纱布过滤,纱布上DNA的黏稠物,DNA溶液,析出DNA黏稠物：,慢加足量蒸馏水：NaCl溶液浓度由_变_,玻璃棒一个方向轻搅拌,DNA析出白色丝状黏稠物，蛋白质溶解,滤取DNA黏稠物：,DNA黏稠物再溶解：,2mol/LNaCl溶液,过滤含DNA的NaCl滤液,DNA溶解、蛋白质沉淀,二层纱布过滤,提取含杂质较少的DNA细丝,含DNA的NaCl滤液,冷却的无水乙醇，玻棒轻搅,乳白色DNA细丝,方案二：直接在滤液中加入嫰肉粉（图5-3），反应1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质方案三：将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温1015min，注意严格控制温度范围讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案二利用了酶的专一性；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。方案三利用了DNA的稳定性。,4、DNA的鉴定,DNA细丝,2mol/LNaCl,含DNA的NaCl溶液,+4ml二苯胺,实验组：,水浴加热,蓝色,等量2mol/LNaCl,+4ml二苯胺,水浴加热,对照组：,无蓝色,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,讨论：,两次蒸馏水,第一次：细胞吸水胀破第二次：使DNA黏稠物析出第三步,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次：DNA存在于滤液里第一步第二次：DNA被留在纱布上第四步第三次：DNA存在于滤液里第六步,两次析出,第一次：用0.14molL的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,1、在制备鸡血细胞液的过程中，加入柠檬酸钠的目的是（）A.防止凝血B.加快DNA析出C.加快DNA溶解D.加速凝血,练一练,2、DNA的溶解度最低时，NaCl的物质的量浓度为（）A.2mol/lB.0.1mol/lC.0.14mol/lD.0.015mol/l3、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是（）A.加快DNA溶解的速度B.加快溶解杂质的速度C.减小DNA的溶解度，加快DNA析出D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,4、向溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水,在这个过程中DNA的溶解度变化情况分别是A减小;减小B增大;增大C先减小后增大D增大;减小5、欲使溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，最有效的办法是A加蒸馏水B加矿泉水C加清水D加生理盐水,6、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是A操作时缓慢滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度B操作时用玻棒轻缓搅拌以保证DNA分子的完整C加蒸馏水可以同时降低DNA和蛋白质的溶解度D当丝状粘稠物不再增加时，NaCl溶液的浓度可以认为是0.14mol/L,7、你能采用其他方法对DNA进行鉴定吗？,用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。,8、DNA遇二苯胺会染成（沸水浴）A硅红色B红色C紫色D蓝色,（二）案例二：以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,1、课前准备,将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24h,2、提取DNA的具体步骤,取材：称取30g菜花，去梗取花，切碎,研磨：将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min,过滤：在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000r/min的转速，离心25min，取上清液放入烧杯中)。在4冰箱中放置几分钟后，再取上清液,沉淀：将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上,
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