广西地方标准《动物源性食品中兽药残留量的测定+液相色谱-质谱质谱法》编制说明

1 广西地方标准 动物源性食品 中兽药残留 量的 测定 液相色谱 质谱 法 (征求意见稿 ) 编制说明 一、 项目来源 根据 广西壮族自治区质量技术监督局关于下达 2015 年第 二批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知（桂质监函2015183 号）文件要求，由广西壮族自治区产品质量检验研究院承担动物源性食品 中兽药残留 量的 测定 液相色谱 质谱法广西地方标准的制定工作。本标准同时也是国家质检总局课题动物源性食品中兽药残留检测方法的研究的科研成果之一。 二、项目背景 药物在预防、治疗动物 疾病中起到积极作用，但 同时又带来了药物残留问题。我国是一个 动物源性食品消耗 大国，随着养殖规模不断扩大，越来越多的药物被应用于 动物源性食品养殖 业生产中，这些药物的使用几乎贯穿养殖的全过程。由于部分养殖户不遵守休药期规定及未正确使用药物，造成药物在 动物源性食品中高水平残留。药物残留通过食物链长期富集而对人体造成诸如 三致作用 、毒性损伤、激素样作用等危害，严重威胁人体健康，已成为人类的隐形杀手。近几年我国出口的 动物源性食品 因药物残留问题也屡遭禁运。我国从保障人民群众健康， 动物源性食品养殖业要持续健康发展， 动物源性食品 要进入国际市场等 方面的 2 需要，必须要严格控制药物的使用。 常规的兽药残留检测方法有微生物法、酶联免疫法和仪器法。微生物法检测灵敏度低、准确性差、检测速度慢；酶联免疫法虽可以快速、高灵敏度检测样品 , 但不能同时检测多种兽药；仪器法准确度高、谱图明晰、可一次检测多种兽药残留。目前，国内关于兽药残留检测的报道多集中于同一类兽药残留的同时检测，如抗生素类药物、喹诺酮类药物以及磺胺类药物等。而不同类兽药多残留同时检测的方法，国外发达国家已有相关报道 4，但是我国目前国内报道还很少 5。 三、标准制定的目的意义 随着许多发达国家对动 物性食品中兽药最高残留限量规定越来越低 , 兽药残留分析对象、样本数量的大大增加 , 迫切需要发展简捷、快速、灵敏 , 能同时处理测定大批量样品的兽药多残留分析技术及标准。 动物源性食品 中兽药残留的主要特点是样品基质复杂 , 残留水平低、 干扰物质多。不同类的兽药由于极性不同 , 化学性质也不同 , 使得同时提取、净化、检测多类兽药残留比较困难。目前我国已制定的兽药残留检测标准均是对某一种或某一类兽药进行检测分析，如水产品中青霉素类药物多残留的测定（ 9682动物源食品中激素多残留检测方法（ 21981动物源性食品中四环素类兽药残留检测方法（ 21317等。但是，对于多种不同结构类型的兽药进行同 3 时检测的相关标准还很少见。美国、日本等多数发达国家已有多种兽药残留量同时检测方法的报道。 我国目前大多数兽药残留检测是采用过净化小柱的方法进行前处理，虽然可以得到相对单一、干净的目标物，但是净化小柱成本不容忽视，并且一种检测方法只能检测一类结构的兽药残留。起草小组认为，使用净化小柱的目的主要是避免基质干扰，不同结构的兽药极性不同，在色谱柱上是可以得到有效分离的。另外，目前液相色谱 全可以弥补即使化合物在色谱柱上出峰时间相近，但可以通过质谱解析化合物分子离子特征峰的方式对化合物进行识别。因此，起草小组认为，通过改进前处理方式，完全可以开发出不使用净化小柱，一次检测多种不同结构兽药残留的高效、快速、准确的检测方法。 广西产品质量检验研究院依据 中华人民共和国农业部 发布的第 193 号 公告 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单 ，针对公告中标出的分属于 5 类不同结构的 8 种不同名称的兽药残留量进行同时测定研究。这 8 种兽药分别为：氯霉素、玉米赤霉醇、克伦特罗、沙丁 胺醇、西马特罗、甲硝唑、二甲硝唑和氯丙嗪。 氯霉素属于酰胺醇类抗生素药物，对 动物源性食品 有很好的广谱杀菌作用；克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗同属于 提高动物屠后肌肉 生深色肉；甲硝唑 、二甲硝唑同属于硝基咪唑类抗生素药物，具有广谱抗厌氧菌和抗原虫作用；氯丙嗪属于二甲胺类抗精神病药物，可用于控制动物 4 精神躁动；玉米赤霉醇属于雌激素类药物，对动植物有增重增产作用。 四、国内相关法律、法规和标准情况的说明 本标准的格式根据 规定编写，引用文件完全符合相关的国家标准，所引用 的规范性文件都是现行有效，与现行法律、法规和有关国家强制性标准相一致。 本标准中 5 类不同兽药单独的检出方法有较多报道，但是，目前国内尚无本标准制定的 8 种 5 类禁用兽药残留量的同时检测相关方法的报道。 五、标准主要技术内容 本方法采用正己烷饱和乙腈在超声波条件下对样品进行提取，提取液经离心分离，残渣用正己烷饱和甲醇 +水溶液溶解，经乙腈饱和正己烷液液分配脱脂，液相色谱 物源性食品 中 8 种混合禁用兽药残留，取得了较好的检测效果。本标准充分考虑了检测方法的适用性及采用主要仪器设备的先进性、可靠性和实用性 。对 生鲜 动物源性食品 中 8 种兽药残留量同时测定方法进行系统研究，主要包括色谱及质谱条件的优化和前处理提取条件的研究。 （一）色谱及质谱条件的优化 1 色谱参考条件 谱柱的选择： 鉴于本方法分离的组分多而且是残留级别的微量检测，选择 5 分离度高的色谱分离柱是首要的工作，本方法所使用的超高效液相色谱系统，压力可达 15000 用较细颗粒粒径固定相的色谱柱，比传统 以在很高的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得快速、高分离度的分离，提高灵敏度，减少基 质干扰。 起草小组分别选用 4种不同规格的色谱柱分离 8种兽药残留，考察分离结果。具体色谱柱规格是： 柱 1： 20 100柱 2： 18(100柱 3： 18(100柱 4： 18(100本标准所选 8 种兽药分属于 5 类不同结构类型，如何寻求并确定一种高效的色谱柱，将各组分 较好分开是本课题的难题之一。在筛选色谱柱的实验中，我们发现 20 种组分分开，但是沙丁胺醇组分的峰与西马特罗组分的峰有叠加，玉米赤霉醇组分的峰与氯丙嗪组分的峰有叠加，加标回收实验表明，使用该柱氯丙嗪回收率只有 70%以下。 18 柱不能将玉米赤霉醇组分的峰与氯丙嗪组分的峰分开，并且对于大部分组分而言，峰形都不理想。 18 柱不能将沙丁胺醇组分的峰与甲硝唑组分的峰分开。 18可以有效的将 8 种组分完全分 开，且各组分峰形均很好， 8种兽药加标回收率可在 80%间。综合考察峰形、分离度及灵敏度，最后 6 选用 18柱。 动相的选择： 由于电喷雾电离质谱的离子化是在溶液状态中进行，因此流动相的组成和添加剂的使用除了会影响目标化合物的分离（保留时间和峰形）外，还会直接影响到目标化合物的离子化效率，从而影响到目标化合物的检测灵敏度。分别采用甲醇 酸铵水溶液、甲醇 醇 酸水溶液、乙腈 腈 酸水溶液作为流动相考察了不同有机相组成对 离子化的影响，同时比较了水相中不同酸碱含量对灵敏度的影响。由于电离模式的不同，氯霉素和玉米赤霉醇在负离子模式下，灵敏度最高。克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、甲硝唑、二甲硝唑和氯丙嗪在正离子模式下，灵敏度最高。我们考察了不同电离模式下，流动相组成对目标物灵敏度的影响。实验表明，正离子模式下，以甲醇 酸水溶液作为流动相的灵敏度。不同水相的结果比较表明， 酸添加量的灵敏度高于其他添加剂。 酸铵的添加明显会导致甲硝唑与地美硝唑的离子 抑制效应，降低了灵敏度；正离子模式下，以纯水作为流动相，不仅导致氯丙嗪组分拖峰严重，灵敏度降低，而且甲硝唑组分与沙丁胺醇组分的出峰时间重合，氯霉素组分与克伦特罗组分的出峰时间重合。但在负离子模式下，甲醇 米赤霉醇的灵敏度。因此，本方法选用了甲醇和 酸水溶液作为正离子模 7 式下的流动相，甲醇和水溶液作为负离子模式下的流动相，并优化得到了最佳的洗脱程序。在相应洗脱程序下， 8种兽药能得到较好的分离度和色谱峰形。 考色谱条件 色谱柱： 18柱（ 100柱温：35，样品温度： 25，进样体积： 20 离子模式下流动相A 为含 甲酸水溶液，流动相 B 为甲醇，流速为 0.3 mL/表 1）。线性流动相梯度洗脱条件见表 1。负离子模式下流动相 A 为含水溶液，流动相 B 为甲醇，流速为 0.3 mL/表 2）。 表 1 正离子模式流动相梯度洗脱程序 时间 / 醇 / % 甲酸水溶液 / % 0 90 起始 0 30 6 0 30 6 5 5 6 5 5 6 0 90 6 0 90 6 表 2 负离子模式流动相梯度洗脱程序 时间 / 醇 / % 水溶液 / % 0 90 起始 0 90 5 5 5 5 5 5 5 0 90 5 0 90 5 2 质谱条件的选择： 电离模式：采用 描；正离子模式仪器参数：气帘气：40，碰撞气：中，离子喷雾电压： 4500V，离子源温度： 550， 8 离子源气 1： 55，离子源气 2： 55；接口加热器：开；采集模式：多反应监测 离子模式仪器参数：气帘气： 40，碰撞气：中，离子喷雾电压： 子源温度： 550，离子源气 1： 55，离子源气 2： 55；接口加热器：开；采集模式：多反应监测 体参数如表 3 所示。 表 3 8 种禁用兽药保留时间与多反应监测条件 序号 中文名称 英文名称 保留时间 定性离子对 定量离子对 去簇电压 碰撞能量 （ （ m/z） （ m/z） （ V） （ V） 1 氯霉素 80 80 玉米赤霉醇 80 29 克伦特罗 0 0 38 0 38 4 沙丁胺醇 0 26 0 西马特罗 0 70 22 31 6 甲硝唑 0 0 31 7 地美硝唑 2 2 38 8 氯丙嗪 0 0 66 采用流动注射泵连续进样，对 8 种兽药各组分的质谱条件进行优化，在正离子和负离子模式下进行全扫描，结果表明：在正离子模式下，克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、甲硝唑、地美硝唑、氯丙嗪全扫描的分子离子 M+H+最理想。在负离子模式下，氯霉素、玉米赤霉醇全扫描的分子离 子 最理想。同时分别对50 ng/单个标准溶液进行分子离子全扫描，然后以分子离子 9 为母离子，对其子离子进行扫描 ,找到两至三个相应信号稳定的子离子作为定性子离子，相应信号较强的子离子作为定量子离子，并优化得到每种兽药的母离子和子离子所需的最佳锥孔电压和碰撞能量。最后以多反应监测（ 式对 8 种兽药残留进行扫描。 （二）提取条件的优化 由于是多种不同种类及结构的兽药，不同型号的固相小柱对不同结构的化合物吸附能力不同，因此样品采用液液萃取法净化。 正己烷可用于除油等非极性杂质，但是单纯用正己烷除 油容易造成损失，本实验采取乙腈饱和正己烷溶液与乙腈一起对样品进行液液分离，减少兽药提取损失。采用甲醇水饱和的正己烷溶液二次萃取也是同样道理。经过该方法净化后，样品提取溶液颜色明显变浅，杂质大大减少，能有效延长色谱柱的使用寿命，减少样品的离子抑制干扰，提高检测的准确度。 （三）定量和定性方式的确定 目前常用的定量方式有外标法、内标法和基质校正三种定量方法，在本标准的制定过程中，分别试验了这三种方式，由于实际样品中存在较强的基质效应，普通外标法使得回收率非常低，不能达到相关要求；内标法回收率很好，但成本较高；基 质校正法既克服了基质效应，又降低了检测成本。所以本标准最终选择基质校正法作为定量方法。 （四）方法线性范围和检出限 准备空白（阴性）样品（鱼肉），取约 品，制备成 10 含 8 种混合兽药 ng/0.1 ng/0.5 ng/1 ng/ ng/10 ng/操作规范进行操作。以添加浓度为横坐标，以响应值为纵坐标绘制标准曲线。 用（ ng/准工作溶液进样分析，结果表明，克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、氯霉素、氯丙嗪在（ ng/硝唑、地美硝唑、玉米赤酶醇在（ ng/准曲线的相关系数均大于 性良好。方法检出限（ 空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比 S/N = 3 计算得出。定量限（ 以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比 S/N = 10 计算得出。 8 种禁用兽药的检出限在（ ng/ 4），可以满足兽药残留痕量分析的需求。 表 4 方法检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数 序号 中文 名称 性范围 线性方程 相关系数 （ ng/ 氯丙嗪 10.0 y=05x+03 克伦特罗 10.0 y=05x+04 沙丁胺醇 10.0 y=05x+04 4 西马特罗 10.0 y=05x+03 5 甲硝唑 10.0 y=05x+04 地美硝唑 10.0 y=05x+04 玉米赤霉醇 10.0 y=05x+03 氯霉素 10.0 y=05x+03 五） 本标准中各兽药检出限与我国现行国家标准中兽药检 11 出限比较 本标准氯霉素、克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙嗪和玉米赤霉醇的检出 限为 g/马特罗、甲硝唑和地美硝唑的检出限为 g/方法进样量为 20 L。本标准方法中克伦特罗、沙丁胺醇、 氯丙嗪、地美硝唑等 4 种兽药残留量检出限等同于国家标准， 玉米赤霉醇 1 种兽药残留量检出限略高于国家标准，西马特罗、甲硝唑和氯霉素 等 3 种兽药残留量检出限略低于国家标准（见表 5）。 表 5 国家现行标准检出限与本标准检出限比较一览表 序号 检测项目 检 测 标 准 检测方法 检出限 ,g/标准检出限 ,g/ 氯霉素 20756 可食动物肌肉、肝脏和水 产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱 S 2 玉米赤霉 醇 23218动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定 液相色谱 S 3 西马特罗 22286动物源性食品中多种 液相色谱串联质谱法 S 4 沙丁胺醇 5 克伦特罗 6 甲硝唑 21318动物源性食品中硝基咪唑残留量检验方法 S 7 地美硝唑 8 氯丙嗪 20763猪肾和肌肉组织中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安残留量的测定 液相色谱 S 本 标准制定的方法可同时测定 8 种 5 类不同结构的 兽药残留量，与我国现行国家标准相比：在检测成本上减少了净化小柱的使用，降低检测成 本；在检验效率上，减少检测 5 类不同结构兽 12 药的人工、溶剂试剂等费用，有效提高检验效率。本标准的发布，对推动我国 动物源性食品 禁用兽药快速检测及监管具有十分重要的意义。 （五）检测方法的回收率实验 为了验证本标准检测方法的准确性和可靠性，我们对草鱼、对虾、花蛤 、鸡和 猪肉 5 份不同样品进行了加标回收实验，结果见表 6。实验数据表明 ,方法的回收率在 73%范围内 ,实验室内精密度 于 间，灵敏度满足国内外兽药残留检测要求，定量结果准确可靠。 13 表 6 8 种兽药加标回收实验结果 兽药名称 动物源性食品种类 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) %） 1 氯霉素 草鱼 80% 93% 7% 对虾 74% 90% 9% 花 蛤 82% 97% 7% 鸡 4% 7% 00% 肉 8% 02% 3% 玉米赤霉醇 草鱼 92% 101% 16% 对虾 90% 104% 24% 花蛤 94% 89% 01% 鸡 86% 96% 9% 猪肉 98% 04% 6% 3 克伦特罗 草鱼 96% 99% 03% 对虾 106% 103% 0% 花蛤 82% 89% 01% 鸡 6% 1% 6% 肉 8% 00% 9% 4 沙丁胺醇 草鱼 73% 88% 4% 对虾 96% 93% 6% 花蛤 80% 89% 7% 鸡 8% 5% 7% 肉 4% 1% 6% 14 兽药名称 动物源性食品种类 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) 添加浓度 /（ g/ 测定值 /（ g/ 回收率/(%) %） 5 西马特罗 草鱼 80% 87% 4% 对虾 107% 98% 3% 花蛤 96% 98% 00% 鸡 08% 04% 8% 肉 8% 94% 9% 6 甲硝唑 草鱼 96% 94% 6% 对虾 98% 93% 0% 花蛤 91% 101% 96% 鸡 00% 6% 8% 肉 5% 7% 9% 7 地美硝唑 草鱼 100% 98% 06% 对虾 98% 98% 89% 花蛤 97% 105% 5% 鸡 2% 7% 7% 肉 06% 5% 4% 8 氯丙嗪 草鱼 88% 110% 5% 对虾 96% 110% 22% 花蛤 86% 84% 4% 鸡 2% 7% 8% 肉 4% 01% 0% 15 （六）样品的实际检测 采用本检测方法对不同 生鲜 动物源性 样品进行检测，分别检测了黄骨鱼、鲤鱼、牡砺 、牛肉、黑土猪肉、土鸡 、西洋鸭、鸡蛋 等样品 47个，均未检出目标兽药残留。 （七）不同检测单位验证 外送 实验样品到广西壮族自治区分析测试研究中心检测，自治区分析测试中心 按照该方法在猪肉中添加 5 g/品回收率为 86% 8 种兽药检出限分别为：氯霉素、玉米赤霉醇、克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙嗪的检出限为 g/马特罗、甲硝唑、地美硝唑的检出限为 g/使用该方法进行猪肉中 8种兽药残留检测，检测结果为未检出。 验证报告见附件 1。 本测定方法经过广西壮族自治区分析测试中心试验验证，检测 结果基本一致，表明本检测方法确实可行，检测数据充足、可靠。 五、结论 为了验证本检测方法可行，根据多批不同来源的实际样品测定结果，对本试验的方法进行反复比较选择和试验，经多次试验以及多批次样品检测验证，制定出本方法标准，规定出 动物源性食品 中氯丙嗪、克伦特罗、沙丁胺、西马特罗、甲硝唑、地美硝唑、玉米赤霉醇和氯霉素等 8 种兽药残留含量的液相色谱 质谱法 测定方法。主要试验方法的依据 16 为参照国家或行业标准，精密度和回收率符合规范要求，试验操作符合国家或行业标准。 六、 主要参考文献（引用的法律法规和有关标准） 1、 6682 分析实验室用水规格和试验方法（ 6682696;1987） 2、 3016 水产品抽样方法 3、 763肉、猪肝、猪尿抽样方法 4、 (a) 药等同时检测方法（畜、水产品）。 (b) 药等同时检测 方法 （畜、水产品） 5、 (a)王舒婷，慕慧，张艳伟，杨云，兽药多残留分析中前处理与检测技术研究进展，中国兽药杂志， 2008， 42，43 (b)曹湛，武力，向蓉，曾振灵，兽药残留分析技术研究进展，中国畜牧兽医， 2008， 35， 95 动物源性食品中兽药残留量的测定 液相色谱 质谱法编制小组 2016年 3 月 28日 17 附件 1 18 19 20 21 22