分子诊断学试卷.docx

分子诊断学试卷A 二、填空（每空0.5分，共15分。请将答案填写在答题纸上）1.从高温嗜热细菌中发现高温DNA polymerase后，使得PCR技术得以广泛应用，在高温下有活性的DNA polymerase有_、_、_、_。其中具有3-5外切活性的高温DNA polymerase有_和_。2.黏粒(cosmid)是质粒噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、cos位点序列来自 ，最大的克隆片段达到45kb。3.感受态细胞(Competent cells)是一种处于_状态的细胞。一般通过_来诱导大肠杆菌感受态的形成。4.PCR反应过程分为三个步骤，即 ， 和 。5. 细菌的移动基因存在着三种类型的转位因子包括 、 、 。6.Klenow酶在 情况下，呈现DNA聚合酶活性，在 情况下呈现外切酶活性。7. 外源基因在原核细胞中表达，常用的启动子有 、 、 、 和 。8. 在LacZ标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显 色，为 性克隆，未插入基因的克隆显 色，为 性克隆。9. 基因序列经碱基替代，缺失或插入后，可使遗传信息产生三种不同的后果，分别为 、 、 。10.由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为 。三、判断题（错的打“”，对的打“”，每题1分，共10分。请将答案填在答题纸对应的题号下）1. Maxam-Gilbert化学降解法测序时，从测序胶上直接读出的序列是用于测序的模板的互补序列。2. 蛋白酶K可有效地降解内源蛋白，能快速水解细胞裂解物中的DNA酶和RNA酶，以利于完整DNA和RNA的分离。3. 电泳时EB加在琼脂糖凝胶中一般会降低DNA在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率。4. 提取DNA时，若用酚除蛋白质，需要用Tris-HCl对酚进行平衡,pH达7.8。5. 基因组研究可以归纳成为构建4张相互关联的基因组图谱：遗传图、物理图、序列图和功能图。6. DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。 7. 质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。8. COS位点，COS质粒，COS细胞它们均含有用于自身环化的12个碱基的互补粘性末端。9. 入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有2个成对的限制性酶切点。10. 原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列，以利于进行有效的转录。四、选择题（每题1分，共15分。请将最佳答案填在答题纸对应的题号下）1. 用于核酸分子杂交的探针不能是放射性标记的( )。ADNA BRNA C抗体 D寡核苷酸2. cDNA文库包括该种生物的( )。A某些蛋白质的结构基因 B所有蛋白质的结构基因C所有结构基因 D内含子和调控区3. 关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( )A溶液I的作用是悬浮菌体 B溶液的作用是使DNA变性C溶液的作用是使DNA复性D质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性4. 有关 DNA 序列自动化测定的不正确叙述是（ ）。 A不再需要引物 B激光扫描分析代替人工读序 C基本原理与手工测序相同 D 用荧光代替了同位素标记5. 在重组 DNA 技术中，不常用到的酶是（ ）。A限制性核酸内切酶 BDNA 聚合酶 CDNA 连接酶 DDNA 解链酶 6. 关于 cDNA 的最正确的说法是（ ）。 A以 mRNA 为模板合成的双链 DNA B同 mRNA 互补的单链 DNA C同 mRNA 互补的双链 DNA D以上都正确 7. 在分离DNA 过程造成DNA 分子断裂的因素很多，下列说法中哪一项是不正确的（ ）。 A核酸酶的降解 B化学降解 C保存液中未加一滴氯仿 D物理剪切8. 下列哪一项不是 Southern blotting 的步骤（ ）。 A用限制酶消化 DNA B DNA 与载体的连接 C凝胶电泳分离 DNA 片段 DDNA 片段转移到硝酸纤维膜上 9. 下列哪种克隆载体对外源 DNA 的装载量最大（ ）。 A粘粒 B酵母人工染色体 C质粒 D噬菌体 10. 人工染色体载体必须具有的元件是（ ）。 A染色体端粒 B着丝粒 C自主复制序列 D以上三项全部 11. 噬菌体外包装目的基因片段的大小应为（ ）。 A.小于噬菌体DNA的50% B. 小于噬菌体DNA的75%C.大于噬菌体DNA的105% D.为噬菌体DNA的75%105%12.识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为（ ）。 A.同工酶 B.同尾酶 C.同裂酶 D.同位酶13.下列生物体的细胞基因组哪些会有断裂基因？（ ） A.大肠杆菌 B.乙肝病毒 C.人 D.噬菌体14. 真核细胞基因表达的特点为（ ）。 A.单顺反子 B.多顺反子 C.转录和转译连续进行 D .转录和转译在同一时空进行15. pBR322质粒作为基因克隆载体不具有下列何种调控元件（ ）。 A.Ampr和Tetr B.ori复制子 C.LacZ标记 D.多克隆位点五、问答题（共36分，请将答案填写在答题纸对应的题号下）1. 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？为什么？（5分）2. 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？（6分）3. 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？（8分）4. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？（8分）5. 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。（9分）答案-试卷A 一、名词解释（每题3分，共24分。请将答案填写在答题纸上）1. 分子诊断：是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状况和疾病做出诊断的方法。2. 实时定量PCR(real-time PCR)：7.实时PCR：通过特定设计的 PCR 仪器来实时检测 PCR 扩增过程每一轮循环产物的累积数量，推算模板的起始浓度，这种工作方式就称为实时 PCR3. 重叠基因：不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用，将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因4. 锌指结构：由两个半胱氨酸（Cys）残基和两个组氨酸（His）残基通过位于中心的锌离子结合成一个稳定的指状结构, 并以锌辅基敖合形成的环状结构作为活性单位, 在指状突出区表面暴露的碱基及其极性氨基酸与DNA结合有关5. 基因置换：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。6. 基因敲除：基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术。7. 基因芯片：将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）。8. 蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能.二、填空（每空0.5分，共15分。请将答案填写在答题纸上）1. Taq DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶 Vent DNA聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶2. 质粒 噬菌体3. 容易接受外源DNA片段 CaCl2法4. 变性 退火 延伸5. 插入序列 转位子 噬菌体Mu和D108 6. 有 dNTP 没有dNTP 7. 乳糖启动子Trp启动子 Tac启动子 噬菌体的PL和PR启动子 脂蛋白启动子 8. 白 阳性 蓝 阴 9. 同义突变 错义突变 无义突变 10. 蛋白质组三、判断题（错的打“”，对的打“”，每题1分，共10分。请将答案填在答题纸对应的题号下）题号12345678910答案四、选择题（每题1分，共15分。请将最佳答案填在答题纸对应的题号下）题号123456789101112131415答案CADADACBBDDBCAC五、问答题（共36分，请将答案填写在答题纸对应的题号下）1. 真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？为什么？（5分）答：不能，因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统。原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子, 以催化RNA的合成。基因表达是以操纵子为单位，操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的。因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列。2. 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？（6分）答：目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 高背景载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5-P，的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。如第二章图2-6 双向插入经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。3. 真核表达调控的顺式作用元件有哪些？其作用特点是什么？（8分）答：顺式作用元件为一些能与DBP结合的特定序列的DNA片段, 决定转录起始位点和RNA聚合酶的转录效应,按功能可分为启动子、增强子、沉默子、衰减子和终止子等DNA序列片段。 启动子真核基因启动子是基因表达时与基因转录起始有关的5端DNA序列,包括在-30bp区富含有AT的典型TATA盒（框）（TATA box）和在-70-80bp区域（在TATA box上游）启动元件。前者是引导RNA聚合酶在正确起始位点转录mRNA所必需的DNA序列, 即保证转录的精确起始。后者UPE是调节转录起始频率和提高转录效率的调控序列，后者的序列常为GGTCAAT和GGGCCC序列, 称为GC box, 它们经协同作用,以调控基因的转录效率。启动子的转录效率因细胞而异，因此需要根据宿主细胞的类型选择不同的启动子，以便真核基因的高效表达。常用的启动子有Rous肉瘤病毒启动子RSV和巨细胞病毒的启动子CMV。还有SV40早期启动子, 腺病毒的晚期启动子。 增强子增强子是使启动子的基因转录效率显著提高（增强转录活性）的一类顺式作用元件，其本身不具有启动子活性，是由多个独立的，具有特征性的核苷酸序列所组成。其基本的核心组件常由812bp组成, 以单拷贝或多拷贝串联的形式存在。增强子一般有以下特性：增强子能提高同一条DNA链上基因转录的速率;增强子对同源或异源基因都有效; 增强子的位置可在基因5上游、3下游或内部; 无方向性,增强子从53或是从35均可对启动子发挥作用; 增强子可远离转录起始点; 增强子一般无基因特异性, 对各种基因启动子均有作用, 但具有组织或细胞特异性。典型的增强子首先发现于SV40的病毒中, 为SV40的早期基因增强子, 约200bp, 含2个72bp的重复序列, 位于早期启动子上游, 增强子可促使病毒基因转录效率提高100倍，因此具有这一增强子的载体已得到了广泛的应用。近些年来，来自于Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列和人类巨细胞病毒（CMV）增强子也已被广泛用于真核细胞的基因表达。增强子能增强启动子的转录能力，有效的增强子能促进转录达10倍或100倍以上, 在某些情况下, 表达产物可能具有细胞毒效应。因此，最好使用一种可被外界刺激信号诱导表达外源基因的诱导型启动子, 诱导型启动子有热休克启动子、金属硫蛋白启动子、糖皮质激和固醇类激素诱导的启动子，热休克启动子的诱导可通过提高细胞的培养温度使启动子转录水平提高，重金属离子可有效地促进金属硫蛋白启动子的转录活性。 RNA剪接信号多数高等的真核基因都含有内含子序列, 在细胞核内转录产生的前体mRNA要经过剪接过程去掉内含子顺序后才成为成熟的mRNA分子。虽然许多基因的cDNA转入哺乳类动物细胞后, 其表达不受有或无内含子的影响, 但有些基因在真核细胞中表达需要有内含子的存在。一般来说，在哺乳动物细胞的表达载体中最好有一段内含子序列的剪接信号，以提供外源基因cDNA表达的需要。常用的内含子剪接序列有SV40的小t抗原的内含子序列等。 负调控元件沉默子和衰减子是抑制基因转录的DNA序列, 称为负调控元件, 它们与反式作用因子相互结合而起作用。这些负调控元件不受距离和方向的限制，并可对异源基因表达起作用。 终止子和polyA信号真核基因转录的确切终止信号和终止机制, 目前尚不清楚, 终止过程不是在RNA聚合酶指导下完成的, 在不明机制下发生转录终止。现在已发现模板DNA分子的3端有转录终止信号序列, 称终止子。通常由转录产生的具有polyA尾的基因终止信号是在多聚腺苷酸化位点下游的一段长度为数百个碱基的DNA区域内的G/T簇, 例如在SV40中的AGGTTTTTT的DNA序列为终止转录调控元件。一般转录终止子为发夹结构的反向重复序列。现在基因工程表达载体上所使用的转录终止子都是病毒基因或细胞基因的3端的一段序列, 其中也包括3端不翻译区。如SV40小t抗原和-球蛋白的转录终止片段常用于构建真核基因表达载体。一般认为polyA的存在增加了mRNA分子的稳定性,使之能成功地进行翻译。准确而有效地进行多聚腺苷酸化需要两种序列：位于polyA位点下游的GU丰富区或U丰富区; 位于polyA位点上游的1130个核苷酸处的一个由6个核苷酸组成的高度保守序列（5-AAUAAA）, 这些序列与转录后的RNA切割和加尾有关。最常用的polyA信号是用SV40的一段237kb的BamHI-BcLI酶切片段, 它包含早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号, 两套信号分别位于不同的DNA链上, 作用方向相反, 它们对mRNA的加工都同样有效。在双启动子的表达载体中，启动子的转录方向为同向时，上游启动的转录由于会穿过下游启动子，这样就使得下游的转录受到极大的影响，造成下游转录水平的下降，但是如果在两个启动子间插入一个转录终止子后，上游启动子对下游启动子的影响就被消除了，这样下游启动子的表达量会有明显提高。当两个启动转录方向相反时，基因表达可能会被转录形成的反义RNA所抑制, 这时插入转录终止子将会消除这种抑制作用。4. 基因工程疫苗研究开发应遵循的原则是什么？（8分）答：(1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，戊型肝炎病毒(HEV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人乳头瘤病毒(HPV)，麻风杆菌，疾原虫、血吸虫等。(2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体，前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV)，还有EBV、CMV、HPV等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV)，肾综合征出血热病毒(HFRSV)；(3)常规疫苗免疫效果差，如霍乱和痢疾菌苗；或者反应大，如百日咳和伤寒菌苗。(4)能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌；5. 有哪几种反义核苷酸基因失活疗法？简述其原理。（9分）答：（1）将特异的反义基因重组到表达载体上（病态载体或质粒），导入靶细胞中转录出反义RNA，形成双链RNA（RNA/RNA双链体），阻碍基因的翻译。（2）人工合成寡聚脱氧核糖核酸（ODN）经过化学修饰导入细胞，与mRNA和DNA结合，形成RNA/DNA杂链或DNA核苷酸三聚体，影响基因的翻译或转录。（3）特异性的核酶，根据癌基因设计出特异的“锤头”或“发夹”结构，它能够催化切割，降解异常表达基因的mRNA而影响基因的翻译。 分子诊断学试卷B二、选择题（每题1分，共15分; 请将答案填写在答题纸上）1. 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是( )。A.修复自身的遗传缺陷 B.促进自身的基因重组C.强化自身的核酸代谢 D.提高自身的防御能力2. 生物工程的下游技术是( )。A.基因工程及分离工程 B. 蛋白质工程及发酵工程C.基因工程及蛋白质工程 D.分离工程 及蛋白质工程3. 基因工程操作常用的酶是:(I 内切酶II 连接酶III 末端转移酶IV聚合酶( )。 A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III4. 限制性内切核酸酶的星活性是指( )。A. 在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。 B. 活性大大提高C. 切割速度大大加快D.识别序列与原来的完全不同5. 下列五个 DNA 片段中含有回文结构的是( )。A. GAAACTGCTTTGAC B. GAAACTGGAAACTGC. GAAACTGGTCAAAG D. GAAACTGCAGTTTC6. 关于cDNA的不正确的提法是( )。A.同mRNA互补的单链RNAB.同mRNA互补的含有内含子的DNAC.以mRNA为模板合成的双链RNAD.以上都不正确7. 下列有关连接反应的叙述，错误的是( )。A. 连接反应的最佳温度为 37 B. 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C. 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD. 连接酶通常应过量 2-5 倍8. T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是( )。A. 2 -OH 和 5 P B. 2 -OH 和 3 -PC. 3 -OH 和 5 P D. 5 -OH 和 3 -P9. 载体的功能是( )。A. 外源基因进入受体的搭载工具 B. 不能为外源基因提供整合能力C. 不能提供复制能力 D. 不能为外源基因提供表达能力10. 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )。A.产生新切点 B.易于回收外源片段C.载体不易环化 D.影响外源基因的表达11. 下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大? ( )A.质粒 B.黏粒 C.酵母人工染色体(YAC) D.噬菌体12. 考斯质粒（cosmid）是一种( )。 A.容量最大一种载体 B.由 -DNA 的 cos 区与一质粒重组而成的载体C.是一种单链DNA环状载体 D.不能在受体细胞内复制，但可以表达13. 13 ( )某一重组 DNA 的载体部分有两个 BamHI 酶切位点。用 BamHI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的 BamHI 酶切位点共有( )。 A.4 个 B. 3 个 C. 1 个 D. 2 个14. 下列哪一种酶作用时需要引物? ( ) A.限制酶 B.末端转移酶 C.反转录酶 D. DNA连接酶15. 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。A.Southem印迹杂交 B.Northem印迹杂交C.Western印迹 D.原位菌落杂交三、简答题（每题5分，共25分; 请将答案填写在答题纸上）1. 什么是包涵体？2. 什么是-互补筛选？3. 简述酶切反应体系及反应条件？4. 核酸操作的基本技术有哪些？5. 基因工程诞生的理论基础是什么？四、论述题（每题10分，共40分; 请将答案填写在答题纸上）1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？ 2. 试述载体构建一般方法。 3. 试述5RACE技术原理和方法4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 答案-试卷B 一、名词解释（每题2分，共20分）1. 转化： 严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程2. 质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。3. cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。4. RACE：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。5. 基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物，组织，器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。6. RT-PCR:先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR。7. 载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是DNA复制子。8.S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3，末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine 、Dalgarno发现，故后来命名为Shine-Dalgarno 序列，简称S-D序列。9. 穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。10.MCS：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。二、选择题（每题1分，共15分）题号123456789101112131415答案DAADDCACDCCBDCC三、简答题（共25分，每题5分）1. 什么是包涵体？答：重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。2. 什么是-互补筛选？答：质粒载体具有-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫互补。3. 限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？答：酶的纯度。DNA样品的纯度。DNA的甲基化程度。酶切反应的温度与时间。DNA分子的构型。限制性核酸内切酶的反应缓冲液。4. 核酸操作的基本技术有哪些？答：核酸提取与纯化核酸的检测与保存核酸的凝胶电泳核酸分子杂交5.基因工程诞生的理论基础是什么？答：是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：证实了DNA是遗传物质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：限制核酸内切酶的发现与DNA切割DNA连接酶的发现与DNA片段的连接基因工程载体的研究与应用四、论述题（每题10分，共40分）1. 如何有效地提高外源基因的表达效率？答：提高启动子强度 缩短启动子同克隆基因间距离 高效的翻译起始序列 高效的转录终止区 提高质粒拷贝数及稳定性 用以下方法提高翻译水平：调整SD序列与AUG间的距离用点突变的方法改变某些碱基增加mRNA的稳定性的 减轻细胞的代谢负荷：诱导表达表达载体的诱导复制 提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：克隆一段原核序列，表达融合蛋白采用某种突变菌株表达分泌蛋白质2. 试述载体构建一般方法。答：A 目的基因分析（1）ORF 分析（2）酶切位点分析B 载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析C 连接体系与连接时间确定3. 试述5RACE技术原理和方法答：PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3或5末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术（RACE）。如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly(A)尾（3末端）或附加的同聚尾（5末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得5末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A)尾。通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。4. 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？答：优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。