分子遗传复习题-21道.doc

非标准答案，仅供大家参考：1.试谈真核生物与原核生物在基因组、基因结构方面的特点及相互间的主要不同点？真核生物原核生物基因组复杂，3109bp，34万个基因，有重复和插入序列，无重叠基因简单，5106bp，4000多个基因，无重复序列和插入序列，有重叠基因转录核内转录，转录与翻译分开，转录后加工，三种RNA聚合酶，I（rRNA），II(mRNA)，III(tRNA，5s，5.8sRNA)，mRNA寿命长，单顺反子转录与翻译偶联，无转录后加工，一种RNA聚合酶，寿命短，多顺反子翻译无SD序列，扫描学说，翻译后加工修饰SD序列，无翻译后加工修饰2.真核基因在大肠杆菌表达的基本条件是什么？可能产生的主要问题是什么？请提出解决问题的原则和方法。【条件】1原核表达载体提供转录、翻译所必须的调控元件，如启动子、转录终止子、核糖体结合位点等。(1)、具有能自主复制的复制子，松弛型，质粒高拷贝数，便于质粒大量制备及表达。(2)、强启动子、强转录终止子，便于高水平转录，防止转录通读。(3)、可诱导性，尤其在高表达对细胞有毒性的蛋白。(4)、合适的核糖体结合位点，提高翻译起始效率和翻译水平。(5)、具有多个单一酶切位点的多克隆位点，且酶切位点最好位于被检测的表型基因上，便于外源基因插入及筛选。(6)、分子量小，便于较大外源基因的插入。(7)、具有抗药性标志，有利于插入外源基因克隆的筛选。(8)、安全，不污染环境，对人无害2外源基因必要条件：不含内含子基因来源：(1)Genomic DNA(原核)；(2)cDNA(真核)；(3)人工化学合成(选择细菌偏爱的密码子)；(4)PCR扩增。【可能产生的主要问题】：(1)表达产物翻译后不能有效地修饰和工。(2)包涵体形成：表达产物需变性、复性，恢复生物活性，有可能造成二硫键错配，表达产物构型不均一性，活性降低或丧失。(3)表达产物N端可能含有甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。解决问题的原则(1) 基因表达水平 既决定于合理设计DNA表达元件，也决定于宿主细胞种类。(2) 基因表达种类 可分为组成型和诱导型两类。(3) 转录和翻译高度偶联、相互影响(4)、以多顺反子形式表达外源基因(5)、考虑缺乏转录后加工、翻译后修饰能力。(6)、考虑质粒的不相容性解决问题的方法1、增加外源基因拷贝数1) 增加质粒拷贝数2)增加质粒稳定性2、转录水平1)强启动子2) 强转录终止子3) mRNA稳定性3、翻译水平 对基因表达有显著的调节作用，主要决定于mRNA的结构特性。4、表达产物稳定性：表达产物不稳定主要是表达产物受蛋白酶降解。5、宿主细胞：质粒拷贝数 转录翻译效率 产物稳定性6、培养、发酵条件等3.简叙噬菌体肽库构建原理，特点及建库时可能存在的问题？【原理】：将大量编码随机肽段的DNA片段插入到噬菌体编码外壳蛋白p或p的基因中，使多肽片段与噬菌体外壳蛋白(p或p)融合表达而呈现在噬菌体颗粒的表面，构建每个噬菌体都带有一个不同肽段的重组噬菌体库，然后用目标蛋白来筛选与之相互作用的噬菌体肽。通过分析所筛到的噬菌体肽的结构和序列，为蛋白质分子之间(如抗原与抗体，受体与配体，酶与底物)的相互作用机理提供依据。(丝状噬菌体：（1）在p和p衣壳蛋白的N端插入外源多肽，外源多肽可展示在病毒颗粒表面，便于相应蛋白受体或抗体识别。（2）易于扩增，易通过感染大肠杆菌得到扩增，便于构库及高通量筛选。（3）在多种洗脱(如低pH值)下，仍然稳定，可以感染形成很高滴度（一般达1012) ）【特点】（1）具有快速、有效、操作简便等特点，大大简化了多肽筛选和鉴定。（2）表型分析和基因型分析同时进行。【存在问题】多样性并不是完全意义上的随机。原因：（1）建库时，密码子的选择和寡核苷酸的合成，即编码肽的基因带有一定的偏向性。（2）库的构建要经原核生物细胞内的层层筛选，多肽不能对宿主细胞有毒性。（3）DNA转化效率受限。（4）筛选灵敏度。多样性高于1012的库，很难富集所需噬菌体肽。4.抗体工程能够实施的理论依据是什么？抗体多样性是怎样产生的？5.简述大肠杆菌的复制过程。复制过程包括：复制起始，复制延伸，复制终止。【复制起始】E.coli复制起始位点称为ori C；复制方向：双向；主要参与蛋白：DNaA：解开oriC；DnaBC复合物：DnaB：解旋酶，DnaC：协助DnaB 。E.coli染色体以一个复制单位从ori C开始双向复制。在ori C上形成两个复制叉，并以大致相同的速度延伸到整个基因组。【复制延伸】复制酶为DNA聚合酶， DNA合成一定需要引物，DNA复制引物为RNA。引发酶是一种与转录不相关的RNA聚合酶，可以合成RNA引物，起始DNA的复制。大肠杆菌的引发酶为一条单肽链，分子量为60KD。DNA合成必需为53，在蛋白复制体参与下DNA进行半不连续复制：复制链方向53，前导链连续复制；复制链方向35，滞后链非连续复制。DNA聚合酶I去除RNA引物。DNA连接酶封闭缺口。【复制终止】环状DNA复制的终止：即两个相反方向复制叉汇合，停止复制，复制体解体其后两条亲代链解开，通过修复方式填补空缺。终止子序列和Tus蛋白(终止子序列结合蛋白)：Tus蛋白与终止子位点ter结合，形成复合物只能够阻止一个方向的复制叉前移，不让对侧复制叉超过中点后过量复制。6.简述真核基因表达的各层次调控。答：真核生物的基因表达受到多级调控系统的调控：1、转录前水平的调节：主要指染色体DNA的断裂、删除、扩增、重排、修饰和异染色质化等改变基因结构和活性的过程；2、转录水平的调节：主要指染色质和基因的活化，包括：通过染色质改建、组蛋白乙酰化使染色质变得疏松，易与酶和调节蛋白作用；基因顺式作用元件和反式作用因子联合调节基因的转录等等；3、转录后水平的调节：主要包括转录产物的加工和转运的调节，如通过不同的剪接方式可产生不同的mRNA；4、翻译水平的调节：是指控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译的调控方式5、翻译后水平的调节：主要指控制多肽链的加工和折叠从而产生不同活性的多肽的调节方式。7.试比较真核和原核生物基因表达调控模式答：1、 原核生物结构简单，信息量少，而真核生物结构复杂，信息量大，同一个个体，基因表达因组织、细胞、时空的不同而不同。原核生物转录和翻译都在基质，甚至在没转录完就开始翻译，基因表达调控主要发生在转录水平，而真核生物转录和翻译分别发生在细胞核和细胞质，即以表达调控可发生在转录前到翻译后的诸多环节中；2、 原核生物转录水平的调控单位是操纵子，可以较为简单地分为正调控和负调控。诱导物与蛋白质结合形成激活子复合物，激活子复合物与启动子DNA结合，激活基因转录，称为正调控；阻遏蛋白分子复合物与基因启动子DNA结合，阻碍RNA聚合酶的工作，使基因处于关闭状态，称为负调控。真核生物转录水平的调控较为复杂，依赖于顺式作用元件和反式作用因子的控制。3、 原核生物基因没有内含子，调控几乎完全由基因上游的RNA聚合酶结合位点控制；而真核生物基因有内含子，使得“可变剪接”成为可能。8.什么叫转座子？ 转座子有哪些特性？转座因子或称可转位因子也称转座子（tansposable elements or transposons）是生物体基因组内一类可以从一个座位转移到另一个座位的DNA序列。【转座子特性】（1）转座的本质 转座的本质是转座子从一个位点转移到另一个新的位点，但在原来位置仍留一份拷贝，转座子与靶序列之间并没有同源性，转座过程也不依赖细菌的RecA蛋白质。（2）插入位点靶序列的复制 转座发生后，受体DNA有一段很短的靶序列会进行复制（512bp），转座子就被夹在两个重复的靶序列之间。不同的转座子，靶序列的长度不同，同一转座子所有靶序列的长度一致，但序列不一定相同。两个顺向重复的靶序列对后续转座没有意义。 （3）靶位点的优先性 有的转座子有特异性整合体现了位置优先性，但更多的是几乎随机整合。大多数的转座子有顺式免疫作用（cis-immunity）避免整合至已存在相同类型的转座子的位点。转座子之间的距离有的很短，有时仅110kb。细菌复制型转座子优先转到质粒上，而不是由质粒转移到染色体上。 9.遗传重组的概念、类型以及意义。【概念】：指遗传物质的重排， 其主要特征是 DNA 双螺旋之间的遗传物质发生交换。遗传重组在减数分裂过程和体细胞核基因中发生，也在线粒体和叶绿体基因间发生。【基本类型】：同源重组；位点特异性重组；转座；异常重组【遗传重组的生物学意义】：（1）遗传重组系统的存在，确保了物种中世代之间基因组的重排，从而形成一个物种个体之间的遗传差异。（2）一个个体的基因组也可以发生重排，产生基因表达的改变，在一个个体的细胞之间产生遗传基因的多样性。（3）遗传重组是变异的来源之一。重组可使有利和不利的基因分离，并作为一个单元在新的组合中被检验。遗传重组可以加速进化的进程。（4）在DNA损伤的修复过程中也起重要作用。10.DNA损伤修复概念、主要类型以及意义。【概念】指生物体修复在生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。【主要类型】光复活修复，切除修复（碱基切除修复和核苷酸切除修复），错配修复，重组修复，SOS修复【意义】可以保持物种遗传特质稳定性。某些修复缺陷所引起的人类遗传疾病：着色性干皮病，科克因综合症，运动失调性毛细血管扩张症。11.诱发突变的常见化学因素有哪些？试述各碱基在化学脱氨剂作用下的脱氨产物与后果。答案要点：诱发突变的常见化学因素包括脱氨剂、烷化剂、碱基类似物、嵌入剂等。化学脱氨剂能够诱导碱基脱氨，如亚硝酸能使A、C、G脱氨基（T无氨基），亚硫酸氢钠则能专一地使胞嘧啶脱氨。各碱基脱氨作用造成的后果正常碱基 互补碱基 脱氨产物 互补碱基 后果 A T 次黄嘌呤 C A-G转换 C G 尿嘧啶 A G-A转换 G C 黄嘌呤 不固定 复制中断 T A 无5-甲基胞嘧啶 G T A G-A转换12.生物进化的驱动力有哪些？各起的作用是什么？答案要点：生物进化是漫长而复杂的过程，它的驱动力包括：突变（mutation）、基因流（gene flow）、随机遗传漂变（random genetic drift）、自然选择（natural selection）和遗传重组（recombination）几个方面。其中突变和遗传重组是种群基因组进化的重要驱动力，突变能够不断增加种群中的遗传变异总量,为进化提供原材料，是遗传变异的根本来源；遗传重组能以更快的速率产生更多更复杂的变异，是遗传变异的现实来源。基因流可以增加种群变异，随机遗传漂变引起隔离小种群内基因频率的随机波动，自然选择是生物进化的定向动力。13.试述肿瘤自杀基因治疗的原理与常用的自杀基因系统。答案要点：肿瘤自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。其基本原理是：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞“自杀”，这些基因也相应地被称为“自杀基因”。 “自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也能够被杀死，此称为旁观者效应。此种效应有力地增强了自杀基因治疗的作用，但因细胞系和自杀基因不同而差异很大，可以不存在，也可以很强大，以致肿瘤内只要有1%5%的转染细胞即可引起几乎全部瘤细胞死亡。常用的自杀基因系统有以下两种：（1）TK/GCV 单纯疱疹病毒型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。（2）CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU），引致细胞死亡。14.试述毕赤酵母表达系统存在的优缺点【优点】高效表达。一般每升表达量在克级以上，如毕赤酵母表达干扰素胞内表达量高达96g/L，分泌型表达量达每升16g以上；博伊丁假丝酵母表达酿酒酵母的腺苷酸环化酶基因每升几克的高表达;诱导型表达。其表达质粒的醇氧化酶(Alcholoxidase,AOX)基因启动子，用甲醇可以严格地调控表达。整合型表达。其表达质粒线性化后可用同源重组的方法整合到酵母的染色体基因组内，因而表达质粒在酵母传代中也是高稳定性的。有完备的工业发酵方法。因为70年代以来甲醇酵母被众多国家作为生产单细胞蛋白（SCP）主要菌种，其工业化规模高密度分批发酵或连续发酵的发酵工艺已相当成熟，而且甲醇酵母发酵的生物量相当大，细胞干重可大100-150克/升以上。培养基价廉。炭源为甘油或甲醇，再补充无机盐、微量元素即可。表达外源蛋白品质较高。甲醇酵母表达的外源蛋白能折叠成具有天然构象的蛋白质，并且能适度糖基化，一般糖链长度为812个糖基，但糖基组分与哺乳动物仍有差异。宿主表达系统安全可靠。甲醇酵母是一种安全宿主，对人类不致病，无毒性，其中Weydemann等人用Hansenulapolymorpha表达系统表达水蛭素(Hirudin)的基因工程产品，根据德国基因技术法(Germangenetechnologylaw)的要求经过严格检验后已被政府权威机构于1995年批准上市。基于以上几方面的优势，甲醇酵母表达系统近年来已引起世界生物技术界的广泛瞩目，尤其是巴斯德毕赤酵母-整合型表达系统是甲醇酵母的代表。【缺点】重组蛋白的糖链结构。 酵母表达 产物易形成高甘露糖型糖链结构，不能与哺乳动物表达系统那样形成复杂型糖链结构。因而对一些目的蛋白的生物活性有影响。表达产物易降解。 由于酵母细胞内蛋白酶较丰富，对内有蛋白酶加工位点的目的蛋白易产生降解。表达产物易形成聚合。 由于酵母启动子强、表达产物分泌或由于目的疏水性强等原因 所致。15.简述以包涵体形式表达的基因工程蛋白药物的制备流程1)种子库的建立: 原始菌种原始种子库工作种子库2)发酵: 工作种子库种子液发酵培养离心收集菌体3)蛋白变性和复性: 菌体破碎收集包涵体包涵体洗涤蛋白变性蛋白复性4)蛋白纯化: 复性蛋白浓缩和初纯化蛋白精纯化无菌过滤原液质检5)制剂: 原液稀释,添加保护剂无菌过滤半成品质检 分装(冷冻干燥) 成品质检16.同源模建的主要步骤有哪些？对于一个未知结构的蛋白质，找到一个已知结构的同源蛋白质，以该蛋白质的结构为模板，为未知结构的蛋白质建立结构模型。答：主要步骤有：1、搜寻模板蛋白或参考蛋白 目标蛋白序列为探针-蛋白质结构库PDB搜索2、序列联配目标：在同源的蛋白质序列中对应氨基酸的对齐。3、确定保守区和可变区结构叠和：参考蛋白的三维结构比对 序列分析：多重序列对比4、结构搭建结构保守区主链-可变区主链-侧链5、结构优化和评估。修正结构中的小误差和错误 保守区-环区、保守区-保守区链接处的肽键和主链二面角修正； 初始结构模型的分子力学松弛优化； 结构模型的分子力学和分子动力学优化。17.人类基因组计划的完成对后基因组时代生命科学研究产生怎样的影响？（1）研究模式的改变：由分析式思维向系统思维的转变；由假说导向向数据导向研究转变。（2）信息化。通过结构基因组学的研究，已获得大量的核酸、蛋白、结构等方面的信息，为功能研究提供基础数据挖掘。（3）在技术上大量采用高通量筛选技术，如基因表达谱、蛋白质组学研究、核酸及蛋白微阵列技术、基因芯片等。（4）多基因整体研究策略，不同于过去一次只研究一个基因或蛋白，注重分子间的相互作用及调控网络。（补充）后基因组时代将是由结构基因组学研究转向功能基因组学研究的时代。18.试述酵母双杂交的基本原理及其应用基本原理：酵母双杂交系统巧妙的利用了真核真核生物转录调节因子的组件式结构特征，因为这些蛋白质往往有两个或两个以上的相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）是转录激活因子发挥功能做必须的。单独的BD能与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使转录激活功能。实验中，首先运用基因重组技术吧编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调节因子DNA结合结构域编码的区(BD)的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调节区结合，准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。此时，若将已知的编码转录激活结构域（AD）的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连，获得“猎物”载体，转化含有“诱饵”的酵母细胞。一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白发生相互作用，不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢，激活报告基因表达。分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互作用的新基因。应用：1、验证已知蛋白间的相互作用2、确定蛋白间相互作用的结构域或重要活性位点3、寻找与靶蛋白相互作用的新蛋白应用最广泛。4、蛋白质相互作用图谱的绘制5、寻找具有药物治疗作用的小分子多肽 如果bait是药物设计的靶标，用双杂交系统可筛 选到一些具有治疗作用的小分子多肽。6、寻找调控蛋白相互作用的化合物 19.模式生物的选择原则和特点分别是什么？目前最常见的遗传学研究模式生物有哪些？答：选择原则（4分）：1) 有利于回答和解决研究者关注的问题;2) 繁殖容易，周期短，研究成本低;3) 遗传背景清楚，有遗传操作的手段;4) 表型分析容易特点（3分）: 1) 生理特征能够代表生物界的某一大类群;2) 容易获得并易于在实验室内饲养繁殖;3) 容易进行实验操作,特别是遗传学分析;最常见的遗传学研究模式生物有（3分）:大肠杆菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、拟南芥等20.检测转基因和基因打靶动物的主要策略和方法。检测转基因动物：报告基因的应用报告基因常与转基因融合以利于转基因动物的检测，和转基因表达模式的测定。常用报告基因包括：lac Z; firefly luciferase; green fluorescent protein(GFP)基因打靶动物的检测方法：（1）。染色体及基因水平的检测Southern blot, PCR （2）。转录水平的检测 northern blot，rt-pcr，RNase保护分析。（3）。蛋白质水平的检测 western blot 原位免疫组化分析。21.基因打靶的主要策略及其在生物医学研究中的主要应用和深远影响。基因打靶的策略： （1）。基因敲除（ES细胞，体细胞） （2）。精细突变的引入。 （3）。染色体组大片段的删除。 （4）。基因敲除的时空调控。 （5）。大规模随机基因敲除基因诱捕。 （6）。在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶。 应用：1。研究基因在发育过程中的功能。 2研制人类疾病动物模型 3改良动物品系 影响：1.基因打靶技术的应用使得许多古老的学科如发育生物学和胚胎学焕发出新的光彩，并直接催生了许多新的学科如遗传生理学。 2.基因打靶技术的发明使得科学家第一次能对关于特定基因生理功能的假设进行试验验证。 3.只有通过基因打靶研究才能真正建立基因和疾病间的因果关系。