《蛋白质生物合成》PPT课件.ppt

蛋白质的生物合成（翻译）,第十五章,ProteinBiosynthesis(Translation),遗传密码三联子tRNA的结构、功能与种类核糖体的结构与功能蛋白质合成的过程蛋白质的运转机制,Contents,本章内容,生物信息的传递从mRNA到蛋白质,翻译：指将mRNA链上的核甘酸从一个特定的起始位点开始，按每三个核甘酸代表一个氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。,第一节蛋白质的合成体系,20种氨基酸(AA)作为原料20多种酶及众多蛋白因子，如IF、eIFATP、GTP、无机离子,参与蛋白质生物合成的物质,三种RNAmRNA（messengerRNA,信使RNA）rRNA（ribosomalRNA,核糖体RNA）tRNA（transferRNA,转移RNA）,蛋白质合成的场所（工厂）是核糖体；运输氨基酸到模板上的是tRNA适配器；模板是mRNA；氨基酸变为活化态与tRNA共价结合形成氨酰tRNA，催化这个过程的酶叫氨酰tRNA合成酶。,一、mRNA及遗传密码,mRNA是蛋白质生物合成过程中直接指令氨基酸掺入的模板，是遗传信息的载体。,（一）mRNA,（二）遗传密码三联体密码,在mRNA的开放阅读框架区，以每3个相邻的核苷酸为一组，代表一种氨基酸(或其他信息)，这种三联体形式的核苷酸序列称为密码子。,1、密码子（codon）,2、三联体密码的破译,核甘酸序列,氨基酸序列,（1）以均聚物为模板指导多肽的合成,1961Nirenberg和Matthaei,polyU-编码Phe,polyC-编码PropolyA-编码Lys,三联体密码破译的实验依据,人工合成多种三核苷酸（UUU、UCU、UGU等）做为模板,与含核糖体、20种AA-tRNA和适当离子强度的反应液保温,利用结合核糖体的AA-tRNA能被吸附的性质，可与未结合的tRNA分开,分析留在滤膜上的核糖体中的AA-tRNA和其相应的模板，即可确定编码特定氨基酸的密码子,三联体密码破译的实验依据,（2）核糖体结合技术：,以随机共聚物指导多肽的合成：以随机共聚物A、C为模板，任意排列可出现8种三聚体，获得六种氨基酸组成的多肽。以特定的共聚物为模板指导多肽的合成：以多聚二核苷酸作模板可合成由2个氨基酸组成的多肽，如PolyUG模板，合成产物为Lys和Val；以多聚三核苷酸作为模板，可得三种氨基酸组成的多肽。,三联体密码破译的实验依据,（3）化学法和酶法相结合：,遗传密码表,1965年完成,终止密码(terminationcodon)：UAA、UAG、UGA3个不编码aa的，为终止密码，不能被tRNA阅读，只被肽链释放因子识别。起始密码(initiationcodon)：AUG编码甲硫氨酸（原核为甲酰甲硫氨酸），为起始密码，常用。少数原核生物是GUG（缬氨酸）：极少用。,3、起始密码子和终止密码子,4、开放读码框架（openreadingframe,ORF),mRNA链上，从5至3，以AUG为起点，每三个碱基作为一个密码子连续阅读，直至出现终止密码子，AUG至终止密码子之间称为ORF。,AUGACAUGCUAUGGUAAUUAA,AUGCUCAAGUAAU,5、遗传密码的特点,（1）方向性(directional),翻译时遗传密码的阅读方向是53，即读码从mRNA的起始密码子AUG开始，按53的方向逐一阅读，直至终止密码子。,（2）连续性(non-punctuated),密码是无标点和不重叠的。编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码子及密码子的各碱基之间既无间隔也无交叉。通常从一个正确起点（AUG）开始，3个一组，一个不漏的读下去至终止密码。,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshiftmutation)。,（3）简并性(degenerate),一种AA可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。除Trp和Met仅有1个密码子外，其余AA均有2个或多个密码子为其编码。为同一种AA编码的各密码子称为同义密码子。如：UUA、UUG、CUU、CUC、CUA、CUG都编码Leu意义：DNA碱基有较大变化时，仍保持多肽链中AA顺序不变。减少有害突变，保证了物种的稳定性。,各种氨基酸的密码子数目,（4）通用性(universal),从简单的病毒到高等的人类，几乎使用同一套遗传密码，因此，遗传密码表中的这套“通用密码”基本上适用于生物界的所有物种，具有通用性。密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。但在1979年发现线粒体的遗传密码与通用密码表有区别，1980年又发现不同生物的线粒体密码也不尽相同。植物细胞的叶绿体密码也不尽相同，可见遗传密码并非绝对通用。,线粒体与核DNA密码子使用情况的比较,密码子的专一性主要由前2个碱基决定，。第三位碱基的改变不重要：如：His：CAU、CAC；第3位均为嘧啶；Glu：CAA、CAG；第3位均为嘌呤。意义：降低了由于第3个碱基发生突变造成的误差。,反密码子与密码子之间的配对有时并不严格遵守常见的碱基配对规律，这种现象称为摆动配对(wobblebasepairing)。,（5）摆动性(wobble),U,321,123,摆动配对,二、rRNA及核糖体,核糖体是蛋白质合成的工厂（场所）,核糖体是由rRNA和多种蛋白质结合而成的一种大的核糖核蛋白颗粒，蛋白质肽键的合成就是在这种核糖体上进行的。1、组成：约65%的rRNA，约35%的蛋白质。,（一）核糖体的组成和结构：,2、结构：,球形颗粒，由大小两个亚基组成。,核蛋白体的组成,（二）核糖体的功能,1、16SrRNA对识别mRNA上肽链起始位点起重要作用。2、参与肽链的启动、延长、终止、移动等,核糖体大亚基X-衍射图,3、功能位点：,1）mRNA结合位点：在大小亚基的结合面上，为蛋白质合成之处。2）P位点：肽酰基位点，大部分位于小亚基上，小部分位于大亚基上，结合起始-tRNA和肽酰基-tRNA。3）A位点：氨酰基位点，位于大亚基上，结合氨酰-tRNA。4）E位点：专供tRNA离开。,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式,A位：氨基酰位(aminoacylsite),P位：肽酰位(peptidylsite),E位：排出位(exitsite),反密码子环,氨基酸臂,三、tRNA氨基酸转运工具,tRNA的二级结构：三叶草结构,DHU环,TC环,与蛋白质合成有关的位点,（1）3末端的CCA序列：为aa接受位点，活化aa的羧基共价结合到3末端A的-OH上，形成氨酰tRNA。（2）反密码子位点：由反密码子环下方的3个碱基组成，与mRNA上密码子的碱基互补。（3）DHU环：识别氨酰-tRNA合成酶的位点。（4）TC环：核糖体识别位点。,tRNA的反密码子与mRNA上的密码子配对,AUC,蛋白质的生物合成过程,第二节,（1）氨基酸的活化（激活）（2）活化氨基酸的转运（3）肽链合成的起始（4）肽链合成的延长（5）肽链合成的终止与释放,蛋白质的生物合成分五个阶段,反应过程,活化场所（部位）：细胞质（胞液）,总反应式如下：,一、氨基酸的活化与转运,氨基酸ATP氨酰-AMPPPi,第一步反应活化,氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRNA合成酶,第二步反应转运,氨酰-tRNA合成酶,氨酰-tRNA合成酶的特点,a、专一性：对氨基酸有极高的专一性，每种氨基酸都有专一的酶，只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。对tRNA具有极高专一性。,b、校正作用：氨酰-tRNA合成酶的水解部位可以水解错误活化的氨基酸。,氨基酰-tRNA的表示方法,丙氨酰-tRNA：Ala-tRNAAla精氨酰-tRNA：Arg-tRNAArg甲硫氨酰-tRNA：Met-tRNAMet,各种氨基酸和对应的tRNA结合后形成的氨酰-tRNA表示为：,氨基酸的三字母缩写-tRNA氨基酸的三字母缩写,例如：,（一）起始氨酰-tRNA,二、肽链合成的起始,原核：fMet-tRNAifMet,真核：Met-tRNAiMet,起始氨酰-tRNA,具有起始功能的tRNAfMet与甲硫氨酸结合后，甲硫氨酸很快被甲酰化为N-甲酰甲硫氨酸(N-formylmethionine,fMet)，于是形成N-甲酰甲硫氨酰-tRNA(fMet-tRNAifMet)，可以在mRNA的起始密码子AUG处就位，参与形成翻译起始复合物。起始密码子只能辨认fMet-tRNAifMet。,起始氨酰-tRNA:fMet-tRNAifMet,二、肽链合成的起始,fMet-tRNAifMet的生成是一碳化合物转移和利用的过程之一，反应由转甲酰基酶催化，甲酰基从N10-甲酰四氢叶酸转移到甲硫氨酸的-氨基上。,Met-tRNAifMet的Met的-NH2被甲酰化,该酶特异性强，不能催化Met或Met-tRNAMet,起始氨基酸的甲酰化,tRNAMet和甲硫氨酸结合后生成Met-tRNAMet，必要时进入核蛋白体，为延长中的肽链添加甲硫氨酸。,（二）参与肽链延长的甲硫氨酰-tRNA：,真核、原核相同：Met-tRNAMet,核糖体30S和50S亚基带有起始密码子AUG的mRNAfMet-tRNAifMet起始因子(initiationfactor,IF)：IF1、IF2、IF3GTP，Mg2+,起始过程所需要的因子,IF-3,IF-1,1、核蛋白体大小亚基分离,IF-3,IF-1,2、mRNA在小亚基定位结合,形成mRNA-30S-IF1-IF3复合物，并使30S小亚基上的P位正好对准mRNA上的AUG位，便于fMet-tRNAifMet进入。,原核生物mRNA在核糖体小亚基上的准确定位和结合的机制,在各种mRNA起始AUG上游约813核苷酸部位，存在一段由49个核苷酸组成的富含嘌呤碱基的一致序列，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(SD序列)，又称核蛋白体结合位点(ribosomalbindingsite,RBS)。,SD序列,3、fMet-tRNAifMet结合到小亚基,IF-3,IF-1,fMet-tRNAifMet进入部分P位，形成GTP-IF2-fMet-tRNAifMet复合物,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4、与核糖体大亚基结合，起始复合物形成,P位：被fMet-tRNAifMet占据；A位：准备接受另一个氨酰tRNA。此时核糖体具有了活性。,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,起始复合物形成过程,指在mRNA模板的指导下，氨基酸依次进入核蛋白体并聚合成多肽链的过程。,1、进位(positioning)/注册(registration)2、成肽(peptidebondformation)3、转位(translocation),肽链延长在核蛋白体上连续循环式进行，又称为核蛋白体循环(ribosomalcycle)，包括以下三步：,每轮循环使多肽链增加一个氨基酸残基。,三、肽链合成的延伸,需要70S的起始复合物氨酰tRNA延伸因子(elongationfactor,EF)：原核生物：EF-Tu、EF-Ts、EF-G真核生物：eEF-1，eEF-2GTP，Mg2,延伸过程需要下列因子参与,1、进位,又称注册(registration)，是指一个氨酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入并结合到核糖体A位的过程,结果：P位：被fMet-tRNAifMet占据A位：氨酰tRNA,进位需要延长因子EF-Tu与EF-Ts参与。,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,进位的反应过程：,成肽是在转肽酶(peptidase)的催化下，核糖体P位上的起始氨酰-tRNA的N-甲酰甲硫氨酰基或肽酰-tRNA的肽酰基转移到A位并与A位上氨酰-tRNA的-氨基结合形成肽键的过程。这时的复合物叫肽基tRNA；P位：tRNAifMetA位：肽基tRNA。,2、成肽,肽链合成延长阶段的肽键形成过程,成肽,转位是在转位酶的催化下，核糖体向mRNA的3-端移动一个密码子的距离，使mRNA序列上的下一个密码子进入核糖体的A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。,转位需要延长因子EF-G参与。,3、转位,转位,EF-G有转位酶（translocase）活性，可结合并水解1分子GTP，释放的能量促进核糖体向mRNA的3端移动，每次移动一个密码子的距离，使起始二肽酰-tRNA-mRNA相对位移进入核蛋白体P位，而卸载的tRNA则移入E位。A位上的肽基tRNA到达P位，A位空出；P位上的tRNA移到E位，再出口，P位上是肽基tRNA。,3、转位,fMet,fMet,成肽转位下一轮进位,肽链合成延长(核糖体循环)过程,终止是指核糖体A位出现mRNA的终止密码子后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体大、小亚基等分离的过程。终止密码：UAA、UAG、UGA终止因子也称为释放因子(releasefactor,RF)：RF1、RF2、RF3,四、肽链合成的终止和释放,RF3可结合核糖体其他部位，有GTP酶活性，能介导RF1、RF2与核糖体的相互作用。,终止（释放）因子的功能,识别终止密码子,RF1特异识别UAA、UAG；RF2特异识别UAA、UGA；RF3刺激RF1、RF2活性，协助释放。,诱导转肽酶转变为酯酶（水解酶）活性,催化新生肽链与结合在P位的tRNA之间的酯键水解，使肽链从核糖体上释放。,当A位上对应于mRNA的终止密码子时，终止因子作用于A位，使P位上的肽基转移酶活性变为水解酶活性，从而使多肽链从核糖体上释放，同时核糖体离开mRNA，解离为50S、30S二个亚基，重新进入下一条多肽链的合成，或变为单核糖体。,原核肽链合成终止过程,多聚核蛋白体的形成可以使蛋白质生物合成以高速度、高效率进行。,多聚核蛋白体(polysome),一条mRNA模板链都可附着10100个核蛋白体，这些核蛋白体依次结合起始密码子并沿53方向读码移动，同时进行肽链合成，这种mRNA与多个核蛋白体形成的聚合物称为多聚核蛋白体(polysome)。,多聚核蛋白体,机理与原核细胞蛋白质生物合成相似，不同之处：1、核糖体更大（80S）2、起始tRNA，原核细胞：fMet-tRNAifMet，真核细胞：Met-tRNAiMet；3、80S起始复合物，多肽合成的起点是mRNA5端的AUG。有九种起始因子eIF；4、肽链延伸、终止和释放。延伸因子为eEF1、eEF2；终止因子为：eRF。5、另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,真核细胞中蛋白质的生物合成,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,蛋白质合成所需能量,在合成1个肽键的过程中：氨基酸活化：2个GTP肽链延长：1个GTP肽链移位：1个GTP共计：4个GTP反应不可逆。能量的消耗保证了翻译的准确性。,第三节蛋白质合成后的加工,新生多肽链不具备蛋白质的生物学活性，必须经过复杂的加工过程才能转变为具有天然构象的功能蛋白质，这一加工过程称为翻译后修饰(posttranslationalmodification)。翻译后修饰包括多肽链折叠为天然的三维构象及对肽链一级结构的修饰、空间结构的修饰等等。翻译后修饰使得蛋白质组成更加多样化，从而使蛋白质结构上呈现更大的复杂性。,一、氨基末端和羧基末端的修饰,细菌蛋白的N端为甲酰蛋氨酸，先由去甲酰化酶催化水解除去N端的甲酰基，再由氨肽酶切去一个或多个N端氨基酸。而真核生物N端的甲硫氨酸常常在肽链的其他部分还未完全合成时就已经被水解下来。羧基末端的某些氨基酸也被特定酶切除。,通过羟基化、磷酸化、糖基化、脂质化、甲基化、二硫键形成、亲脂性修饰等使蛋白具有生物活性。如Ser、Thr、Tyr上的羟基的磷酸化,二、AA残基的修饰,三、切去一端肽链,1、酶原激活：经过特殊剪切，在酶催化下水解，切除一段肽链后才能显示出生物活性。如前胰岛素转变为胰岛素的过程,2、切除信号肽：某些蛋白质的合成过程中，氨基末端有15-30个AA组成的信号序列，用来引导蛋白质到达细胞特定部位而发挥作用，称为信号肽(signalpeptide)，最后这些序列在特定肽酶作用下被切除。,胰岛素原（86肽）,胰岛素的翻译后加工,四、多肽链折叠为天然构象的蛋白质,新生肽链N-端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，形成完整的空间构象。一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶和蛋白质辅助，如分子伴侣等。,几种有促进蛋白质折叠功能的大分子,分子伴侣(molecularchaperon)蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase,PDI)3.肽-脯氨酰顺反异构酶(peptideprolyl-cis-transisomerase,PPI),五、空间结构的修饰,结合蛋白质合成后都需要结合相应辅基，才能成为具有功能活性的天然蛋白质。,具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体(oligomer)。,（一）通过非共价键亚基聚合形成具有四级结构的蛋白质,（二）辅基连接后形成完整的结合蛋白质,第四节、蛋白质的定向运转,蛋白质在核蛋白体上合成后，必须分选出来，定向输送到一个合适的部位才能发挥各自的生物学功能，这种将蛋白质定向输送到其发挥作用的靶位点的过程称为蛋白质的靶向输送（proteintargeting）。蛋白质的靶向输送与翻译后修饰过程同步进行。,所有靶向输送的蛋白质结构中存在信号肽，主要是N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位。信号序列是决定蛋白质靶向输送特性的最重要元件，提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于蛋白质自身的一级结构中。,一、靶向输送的蛋白质N-端存在信号序列,信号肽的一级结构,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,靶向输送到细胞核的蛋白质多肽链内含有特异信号序列，称为核定位序列(nuclearlocalizationsequence,NLS)。NLS为含48个氨基酸残基的短序列，富含带正电荷的赖氨酸、精氨酸和脯氨酸，可位于肽链的不同部位，而不只在N末端。不同的NLS间未发现共有序列；在蛋白质进核定位后，NLS不被切除。,核定位序列,靶向输送蛋白的信号序列或成分,二、线粒体蛋白的靶向输送,三、细胞核蛋白的靶向输送,