高中生物 第1部分 微生物的利用 实验1 大肠杆菌的培养和分离教案 浙科版选修1

实验1 大肠杆菌的培养和分离课标解读重点难点1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。1.微生物实验的无菌操作。2.利用LB液体培养基进行细菌培养。3.利用LB固体培养基分离大肠杆菌。4.划线分离法和涂布分离法。一、大肠杆菌1大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。2在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。3大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。二、实验内容1本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。2本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。三、细菌的培养和分离1细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。2细菌的分离(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养1020 h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？【提示】取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释105107倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。四、灭菌操作1各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 、15 min)处理，并在超净台上使用。注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。2各种培养基必须是无菌的。3细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤1在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。2灭菌后待培养基冷却至60 时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？【提示】酒精灯火焰旁约10 cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。3扩大培养先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。4划线分离用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ，恒温培养箱中培养1224 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。5. 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养24 h后，置于4 冰箱中保存。微生物培养的基本条件1.培养基及其类型(1)培养基：概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。(2)培养基的种类划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂微生物的扩大培养、工业生产半固体培养基加凝固剂，如琼脂观察微生物的运动、分类鉴定固体培养基微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐)用途鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽)2.无菌技术进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。3消毒和灭菌的比较概念常用方法应用的范围消毒使用较为温和的物理或化学方法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法：在100 开水中煮沸56 min一般物品巴氏消毒法：7075 煮30 min或在80 煮15 min对于一些不耐高温的液体，如牛奶化学药剂消毒法如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等灭菌使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)灼烧灭菌：酒精灯火焰接种工具的灭菌干热灭菌：干热灭菌箱内160170 下灭菌12 h玻璃器皿、金属工具的灭菌高压蒸汽灭菌：121 条件下，灭菌1530 min培养基及容器的灭菌注：消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。(1)制备培养基：根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。对细菌进行大量的扩增，用_培养基进行培养；对细菌进行分离，用_培养基进行培养。(2)灭菌：在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种_都必须是无菌的。对它们进行灭菌，通常用_法灭菌。(3)接种及培养：接种时常用的工具是_和玻璃三角刮刀。 为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于_中培养，培养的温度设定在37 。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种_作为对照进行实验。(4)菌落观察计数：培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_。(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_细菌。【思路点拨】(1)细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。实验室中常用高压蒸汽灭菌法。(3)接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。【答案】(1)液体固体平面(2)器皿和培养基 高压蒸汽灭菌(3)接种环恒温培养箱无菌水 (4)多高(5)盐(或NaCl)1细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A接种环、手、培养基B高压锅、手、接种环C培养基、手、接种环D接种环、手、高压锅【解析】此题考查对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。【答案】C大肠杆菌的培养和分离1.LB培养基的制备(1)计算：根据LB培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。(2)称量：准确地称取各种成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化钠0.5 g，加水50 mL。(如配LB固体培养基，则再加1 g 琼脂)(3)制备空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2 mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。2进行大肠杆菌培养与分离操作(1)灭菌(2)制备LB固体平面培养基倒平板操作待培养基冷却至60 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作描述如下：(3)扩大培养左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。三角瓶在37 摇床振荡培养12 h。(4)划线分离取种在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。平板划线操作在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。培养将上述划线操作后的培养皿倒置放至37 恒温培养箱中培养1224 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。(5)菌种纯化与保藏在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 培养24 h后，4 冰箱保存即可。划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程：请回答：(1)灭菌常用_法，灭菌后，要待_时才能打开锅盖。(2)倒平板和接种前要用_擦手。接种和划线前使用_的方法对接种环灭菌。(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取_次。下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。(4)划线后在恒温培养箱中培养时，培养皿须倒置，目的是_。(5)实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？_。【思路点拨】此题考查大肠杆菌的培养和分离过程，具体分析如下：(1)灭菌是指对LB液体培养基和LB固体培养基进行的灭菌。对培养基进行的灭菌应该是用灭菌锅进行高压蒸汽灭菌。灭菌后，灭菌锅内的压力与大气压相同时，才能打开灭菌锅，否则会造成培养液溅出。(2)在进行实验操作时，操作者的双手要用酒精棉球擦拭消毒，接种环要用火焰烧灼灭菌。(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取菌液1次然后连续划线。(4)在培养时，培养皿须倒置，目的是防止冷凝后形成的水滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。(5)实验完成后，接触过细菌的器皿应灭菌处理以防止污染。【答案】(1)高压蒸汽灭菌锅内压力与大气压相同(2)酒精棉球(酒精灯火焰上)灼烧(3)1(见右图)(4)避免水滴污染培养基(5)接触过细菌的器皿应作灭菌处理划线分离操作第一次划线及每次划线之前都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：第一次灼烧每次划线之前灼烧划线结束灼烧目的避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。划线时最后一区域不要与第一区域相连。划线用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。2下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答：(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为_培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持_。对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的_(填“前面”或“后面”)。(2)D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是_。E过程所需的温度是_。(3)D过程后，一个菌体便会形成一个_，这种分离方法是_的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。【答案】(1)LB渗透压前面(2)琼脂4 (3)(单)菌落消除污染杂菌(纯化菌种)1下列有关倒平板操作错误的是()A将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上B使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上D等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置【解析】整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵，因此，灭过菌的培养皿放在火焰旁，打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰，培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不能将培养皿盖完全打开，等待平板冷却凝固后需要将平板倒过来放置。【答案】C2无菌技术包括以下几个方面的叙述，其中错误的是()A对培养操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌B对培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌C为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行D实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触【解析】灭菌是采用强烈的理化因素对用于微生物培养的培养皿、接种用具和培养基进行处理，使物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子都要被杀死；实验操作者的衣着和手以及操作空间只能进行消毒。【答案】A3下列依次表示倒平板、接种的位置，以及划线法接种的路径示意图，其中错误的是()【解析】在划线时，应在第一区的划线末端开始往第二区域内划线，在第二区的划线末端开始往第三区划线。【答案】D4关于大肠杆菌的培养和分离实验以下叙述不正确的是()A本实验的内容是将大肠杆菌进行扩大培养和划线分离B本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，再在LB固体平面培养基上划线进行大肠杆菌的分离C除划线分离外，也可用涂布分离法分离大肠杆菌，两种分离方法中划线分离方法简单且单菌落更易分开D进行培养之前对加入培养基的三角瓶、试管也要在121 下灭菌15 min【解析】划线分离与涂布分离均可实现对大肠杆菌的分离，其中划线分离法操作简单，但单菌落相对不易分开，涂布分离法操作虽相对复杂，但单菌落更易分开。【答案】C5微生物与人类关系密切。虽然有些微生物能使动植物患病，但多数微生物对人类是有益的。请回答：(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供_。对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_。接种时通常采用_法。(2)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，要将平板倒置的原因是_。(3)微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和_法。在用平板划线法接种时，在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环的目的是_。在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？_。【答案】(1)氮源(碳源)、碳源高压蒸汽灭菌平板划线(2)皿盖上会凝有水珠，防止水珠落入培养皿造成污染，还可使培养基表面的水分更好地挥发(3)稀释涂布平板第一步灼烧接种环是防止接种环上有其他微生物而污染培养基。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次接种时留下的菌种，使下一次划线时接种环上的菌种直接来自上次划线的末端，以便通过多次划线后，得到单个的菌落划线结束后仍要灼烧接种环，以免菌种对环境造成污染和感染操作者学业达标测评(一)大肠杆菌的培养和分离1要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用()A固体培养基B液体培养基C加青霉素的培养基D加入高浓度食盐的培养基【解析】分离微生物应使用固体培养基。【答案】A2涂布平板操作需要用到()A接种环、滴管、酒精灯B接种环、移液管、酒精灯C涂布器、移液管、酒精灯D涂布器、接种环、酒精灯【解析】涂布平板操作过程中不需要接种环。【答案】C3采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌()A接种环、吸管、培养基、接种室B吸管、接种环、培养基、接种箱C培养基、接种环、吸管、接种箱D培养皿、吸管、培养基、双手【解析】干热灭菌主要对玻璃器皿进行灭菌，紫外线主要对接种室和接种箱进行空气和表面灭菌。【答案】B4下列操作错误的是()A用酒精擦拭双手B用氯气消毒水源C实验室用紫外线进行消毒D玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精直接擦拭即可达到彻底灭菌的目的【解析】玻璃器皿应用干热无菌箱在160170 加热12 h才能达到无菌目的。【答案】D5在涂布平板操作时错误的是()A将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红B取少量菌液滴加在培养基表面C将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却810 s再用D涂布时可转动培养皿，使涂布均匀【解析】涂布平板所用涂布器是玻璃器皿，不能在酒精灯火焰上灼烧，否则会变形，正确方法是沾取少量酒精，引燃。【答案】A6利用涂布分离法纯化的大肠杆菌，经培养后发现培养基上出现了多种菌落，不可能的原因是()A培养基制备过程中被杂菌污染B接种过程中，无菌操作不符合要求C系列稀释时，无菌操作不符合要求D由大肠杆菌的种类不同造成的【解析】大肠杆菌培养基中出现了多种菌落，说明污染了杂菌，杂菌可能来自培养基，也可能是因为操作过程中无菌操作不符合要求。【答案】D7下列与大肠杆菌及其培养与分离的相关叙述正确的是()A大肠杆菌是革兰氏阳性菌B大肠杆菌的代谢类型是异养需氧型C可用LB固体平面培养基扩大培养大肠杆菌D进行平板划线分离时，接种环只需蘸菌液一次【解析】大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其代谢类型为异养兼性厌氧型，扩大培养大肠杆菌宜使用LB液体培养基，LB固体平面培养基可用于划线分离，进行划线分离时，为达到分离目的，获得单菌落，接种环只需蘸取菌液一次，故只有D选项所述正确。【答案】D8(2016杭州检测)请回答微生物培养的有关问题：(1)人们按照微生物对营养物质的不同需要，配制出供其生长繁殖的营养物质称培养基。培养基之所以有_、_和半固体培养基等三种，主要是培养基中所添加的_含量不同。(2)微生物个体是肉眼看不见的，但固体培养基上的微生物的_是可见的，该结构的特征常常是鉴定菌种的主要依据之一。(3)微生物的营养包括碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。培养乳酸杆菌时，在培养基中所添加的维生素属于_；在培养基中添加酸或碱或缓冲溶液的作用是_。(4)培养微生物的操作必须实行无菌操作，以防止_的入侵等作用。无菌操作主要包括_和灭菌；前者不能杀死芽孢和孢子，后者能杀死芽孢和孢子。(5)微生物接种的方法很多，最常用的是_和_。【答案】(1)固体培养基液体培养基琼脂(凝固剂)(2)菌落(3)生长因子调节培养基的pH(酸碱度)(4)外来杂菌消毒(5)平板划线法稀释涂布平板法9从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样富集培养纯种分离性能测定。(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养耐盐菌的菌样应从_中采集，培养厌氧菌的菌样应从_中采集。(2)富集培养指创设仅适应于该微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需特定微生物的培养方法。对耐盐菌富集培养的培养基应是_的选择培养基；对高温淀粉酶的富集培养应选择_的选择培养基，并在_条件下培养。(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的_等物质发生_。_灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的灭菌法。(4)下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。获得图A效果的接种方法是_，获得图B效果的接种方法是_。【答案】(1)高盐环境无氧环境(2)加盐以淀粉为唯一碳源高温(3)蛋白质和核酸变性高压蒸汽(4)(稀释)涂布分离法划线分离法