SOD工程菌的构建实验报告

生物工程综合实验-SOD工程菌构建实验报告集班级生物工程 1411学号_实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。二、严格按照实验要求，做好实验预习，实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事地完成实验报告，杜绝弄虚作假。三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室抽烟和 吃东西。六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室外的清洁卫生工作， 经指导老师许可后，方可离开。预习报告名称 SOD工程菌构建日期 201712.11-12.13实验目的和要求：工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高 效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面 具有重要作用。SOD （超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代谢过程中产生的有害物 质。人体在不断地补充SOD后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此， 采用工程菌的原理和方法，体外大量合成 SOD，有利于降低其生产成本，扩大使用围。了解 PCR的原 理和实验流程。了解质粒提取的原理和方法。了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连 接和平端连接的差异。了解 CaCl2法制备大肠杆菌DH5 a感受态及转化的原理。了解 SDS-PAGE检测 蛋白质的原理和方法。实验材料：pCM-T-SOD质粒、Taq DNA聚合酶、SOD特异性引物、dNTPs PET-32A质粒、质粒提取 试剂盒SOD基因（PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和Hi ndlll限制性切酶大肠杆菌 DH5 a， 1M预冷的CaCI2溶液，LB培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Tris-Hcl， 10% SDS，TEMED，10% AP （过硫酸铵），30%丙烯酰胺单体（29: 1）主要仪器：PCR仪水平凝胶电泳仪摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱垂直电泳系统、水浴锅主要步骤：一. PCR扩增SOD基因及胶回收纯化PCR扩增在PCR管中，加入如下PCR反应物：名称体积（卩l）10X Taq buffer5SOD上游特异性引物1SOD下游特异性引物1dNTPs1.5质粒模板3Taq聚合酶0.5无菌水38总体积502. PCR反应条件95C5min95C30s55 C30s30个循环72 C1min72 C10mi n4CPause2. 1% TAE凝胶电泳A.胶回收PCR产物1） 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若得到目的条带可进行大批量 PCR，回收目的片段；2） 通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5 mL小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100 mg琼脂凝胶相当于100卩L体积。称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液 BD ;3）5565 C水浴710 min直至胶完全融化，期间振荡 3次，琼脂糖必须完全融化：4） 将溶液置于DNA纯化柱中，静置2 min ,12000 rpm离心60 s；若一次加不完，可分两次离心，弃 滤液；5） 加入500卩L溶液PE （初次使用前用无水乙醇按1: 4稀释）于离心柱中，12000 rpm离心60 s, 弃滤液；6） 用溶液PE 500卩L再洗一遍，12000 rpm离心60 s,弃滤液；12000 rpm再次离心2 min，以甩干 剩余液体；7） 将离心柱置于新的离心管中，加入 60 C预热的30100卩L溶液Eluent于纯化柱中（硅胶膜中 央），静置2 min, 12000 rpm离心60 s,管底即为回收 DNA8）重复步骤7；9）无菌水溶解DNA，贮存于-20 C。二. PET-32A质粒提取1. 取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过 夜菌沉淀。2. 每管加入250微升溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3. 每管加入250微升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。4. 每管加入350微升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。5. 最高速（13,000rpm左右）室温离心10分钟。6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。最高速离心30-60秒，倒弃收集管液体。7. 在质粒纯化柱加入750微升溶液IV,最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管液体。8. 最咼速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。9. 将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管柱面上，放置1分钟。10. 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。11.0.8% TAE凝胶电泳检测质粒完整性。三. 双酶切SOD基因和PET-32A质粒的双酶切及连接A. SOD基因和PET-32A质粒的双酶切1. 在EP管中，加入如下双酶切体系名称加入体积（ul）10 x Buffer M2EcoRV限制性切酶1HindHI限制性切酶1SOD基因/PET-32A质粒8无菌水8总体积20ul2. 上述反应体系，37C反应2h。B. 酶切产物的回收C. 酶切片段连接1. 在EP管中，加入如下反应体系名称体积（ul）10X T4 DNA连接酶 buffer2SOD基因酶切片段5PET-32A质粒酶切片段5T4 DNA连接酶1无菌水7总体积20ul2. 16C,反应过夜。四. DH5a感受态制备及转化A. 感受态制备1. LB培养基配制：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCI,调节pH至7.2，定容至1L。 咼温咼压火菌。2. 转移0.1ml DH5a菌液于一只装有 5-8 ml LB的试管中.于37C下，250rmp振荡培养2到2.5小 时（检测0D600,控制其在0.4-0.5之间）。3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。4. 加入5毫升冰冷的CaCl2溶液，并轻微打匀。5. 4C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。6. 加入0.5ml （每25 ml初始培养物加入1ml）冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。冰浴放置 20min。7. 此时的感受态细胞可直接进行转化操作，也可以分装，加入1/10体积的30%甘油后于-70 冰冻保藏。B. 转化1. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml EP管中转移100ul感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加 入10ul连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置 30到40分钟。2. 把转化管转移至放于42循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管）3. 把EP管迅速转移至冰浴2到3分钟。随后向每个EP管中加入500ul LB培养基。37 200rmp 摇菌45min，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。4. 上述反应物4000rmp离心2min，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过 200，吹打混匀，随 后涂布于含有amp的LB-琼脂平板上。5. 37 T放置平板直到其上液体被吸收。6. 于37倒置平板培养。转化克隆应该于12-16小时区间出现。7. 挑取单菌落，置于6 ml含有amp的LB液体培养基中，37C 250rmp摇菌培养8h。五. SDS-PAGE佥测SOD蛋白的表达1. 取4 ml转化成功的菌液，加入1 ml蛋白上样缓冲液，100C裂解10min。2. 4C，12000rmp 离心 5min，收集上清。3将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。4. 按如下体积配制10%分离胶8 ml，混匀：双蒸水3.0ml1.5MTris-HCI2.1mlpH8.830% Acr-Bis2.8ml10% SDS100ul10% AP50ulTEMED5ul5. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min后胶即可聚合。6. 按如下体积配制4%浓缩胶3.0ml，混匀：7. 将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。8. 装好电泳系统，加入点击缓冲液，上样15ul。9. 调节电压至80V，待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至 120V，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。10. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色2h，加入脱色液，置于摇床中，脱色。期间每30min 更换一次脱色液，至完全脱净。教师签名:实验报告SOD工程菌构建一、目的：了解PCR勺原理和实验流程。了解质粒提取的原理和方法。了解酶切的原理和方法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。了解CaCl2法制备大肠杆菌DHa感受态及转化的原理。了解SDS-PAGE 检测蛋白质的原理和方法二、原理：工程菌是利用基因工程的方法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多方面具有重要作用。S0（超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代谢过程中产生的有害物质。 人体在不断地补充SOD后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此，采用 工程菌的原理和方法，体外大量合成 SOD有利于降低其生产成本，扩大使用围。三、实验材料与方法1实验材料与试剂：pCM-T-SOC质粒、Taq DNA聚合酶、SOD特异性引物、dNTPs PET-32A质粒、 质粒提取试剂盒SOD基因（PCR回收产物）、PET-32A质粒、EcoRV和HindIII限制性切酶大肠杆菌DH5 a，1M预冷的CaCI2溶液，LB培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液，Tris-Hcl ， 10% SDS TEMED 10% AP （过硫酸铵），30%丙烯酰胺单体（29: 1）2、 实验仪器：PCR仪水平凝胶电泳仪 摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱 垂直电泳系统、水 浴锅3、实验方法：一. PCR扩增SOD基因及胶回收纯化PCR扩增胶回收PCR产物1）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若得到目的条带可进行大批量 PCR回收目的片段；2） 通过把切取含DNA片段的琼脂凝胶装在1.5 mL小离心管中，称其重量近似地确定其体积，每100 mg 琼脂凝胶相当于100卩L体积。称量每次切取含DNA片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液 BD3） 5565 C水浴710 min直至胶完全融化，期间振荡 3次，琼脂糖必须完全融化；4）将溶液置于DNA屯化柱中，静置 2 min，12000 rpm离心60 s ;5） 加入500卩L溶液PE于离心柱中，12000 rpm离心60 s，弃滤液；6） 用溶液PE 500卩L再洗一遍，12000 rpm离心60 s，弃滤液；12000 rpm再次离心2 min，以甩干 剩余液体；7）将离心柱置于新的离心管中，加入 60 C预热的30100卩L溶液Eluent于纯化柱中（硅胶膜中 央），静置2 min，12000 rpm离心60 s，管底即为回收 DNA8）重复步骤7；9）无菌水溶解DNA贮存于-20 C。二. PET-32A质粒提取1. 取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过 夜菌沉淀。2. 每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3. 每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。4. 每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。5. 最高速（13,000rpm左右）室温离心10分钟。6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。最高速离心30-60秒，倒弃收集管液体。7. 在质粒纯化柱加入750微升溶液IV,最高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管液体。8. 最咼速再离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。9. 将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管柱面上，放置1分钟。10. 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。11. 0.8% TAE凝胶电泳检测质粒完整性。三. 酶切SOD基因和PET-32A质粒的双酶切及连接SOD基因和PET-32A质粒的双酶切在EP管中，加入如下双酶切体系名称加入体积（ul）10 x Buffer M2EcoRV限制性切酶1HindHI限制性切酶1SOD基因/PET-32A质粒8无菌水8总体积20ul上述反应体系，37 C反应2h。酶切产物的回收四. DH5a感受态制备及转化感受态制备1丄B培养基配制：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaC|调节pH至7.2，定容至1高温高压灭菌。2.转移0.1ml DH5a菌液于一只装有5-8 ml LB的试管中.于37下，250rmp振荡培养2到2.5小时（检测0D600,控制其在0.4-0.5之间）3.4.5.6.室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀加入5毫升冰冷的CaCI2溶液，并轻微打匀。4 C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。20mi n。加入0.5ml （每25 ml初始培养物加入1ml）冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。冰浴放置7.此时的感受态细胞可直接进行转化操作，也可以分装加入1/10体积的30%甘油后于-70 C冰冻保藏转化8. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml EP管中转移100ul感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入10ul连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置 30到40分钟9. 把转化管转移至放于42 C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管）10. 把EP管迅速转移至冰浴2到3分钟。随后向每个EP管中加入500ul LB培养基。37C 200rmp 摇菌45min，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。11. 上述反应物4000rmp离心2min，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过 200ul，吹打混匀，随 后涂布于含有amp的LB琼脂平板上。12. 37C放置平板直到其上液体被吸收。13. 于37C倒置平板培养。转化克隆应该于 12-16小时区间出现。14. 挑取单菌落，置于6 ml含有amp的LB液体培养基中，37C 250rmp摇菌培养8h。五. SDS-PAGE佥测SOD蛋白的表达1取4 ml转化成功的菌液，加入1 ml蛋白上样缓冲液，100C裂解10min。24C, 12000rmp离心5min，收集上清。3将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。4.按如下体积配制10%分离胶8 ml,混匀：5向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min后胶即可聚合。6按如下体积配制4%浓缩胶3.0ml，混匀：7将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。8装好电泳系统，加入点击缓冲液，上样 15ul。30min 更9调节电压至80V，待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至 120V,电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。 10.卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色 2h，加入脱色液，置于摇床中，脱色。期间每 换一次脱色液，至完全脱净。四、实验结果与分析：1.SOD基因和PET-32A质粒的双酶切产物电泳图2.SOD表达产物电泳图3.转化平板图4.PCR产物凝胶电泳图分析：经过提取质粒、PCR扩增SOD基因、酶切连接SOD基因和PET-32A质粒、制备感受态及转化和 SDS-PAGE检测SOD蛋白的表达等过程，理论上来说是可以构建出含有 SOD的工程菌，但实验最后菌 落没有生长，应该是人为操作失误，可能是在接种时，未等接种环完全冷却就去接种，导致菌最后死亡。五、结论工程菌是用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系，是采用现代生物工程技术加工 出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点，同时也在生产方面得到了大量的应用。本次 实验通过学习最基本的SOD工程菌的构建，从而让我们掌握了基因工程相关的基本操作和数据分析， 虽然本次实验最终没有得到相应的 SODT程菌，但是实验的过程才是最重要的。参考文献：1 海玲，超,程欲等超氧化物歧化酶重组酵母的构建及其发酵条件的优化J.食品与生物技术学报,2017,36(9):918-921.DOI:10.3969/j.iss n.2 建荣,晓瑜,步得志等.国产和进口培养基发酵培养重组人SODT程菌的比较研究J.中国医药生物技术,2007,23 母茜，蔡勇，王肇悦等.采用自克隆技术构建高SOD低双乙酰的啤酒酵母工程菌J.食品科学