微生物的遗传变异和育种张传富课件

第八章微生物的遗传变异和育种 后来，有三位科学家将第三组实验进行如下改进：从高温灭活的S型细菌中提取几种细胞成分(如DNA、蛋白质、荚膜多糖等)分别进行转化实验 AveryAvery实验，如图示：实验，如图示： Pr 只含S不含PDNA只含P不含S原理步骤1：用含同位素35, P32的培养基培养大肠杆菌2：让T2感染上述大肠杆菌使其打是S35P32标记3：吸附10分钟后搅动离心上清液沉 淀结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性 烟草花叶病毒（TMV）是一种只含RNA的植物病毒，其中94%是蛋白质外壳，6%是RNA。可在烟草上引起病斑。把TMV放在水和苯酚中震荡，可将病毒的蛋白质外壳和RNA分开，分开的蛋白质外壳和RNA分子又能重新组合成具有感染力的完整病毒粒子。另一株与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒（HRV），也可引起病斑。但两种病斑的表征不同。 1956年，Fraenkel-conrat利用这两株植物病毒的核酸和蛋白质的拆、合及相互对换进行实验如下图。TMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆开拆开 重建重建 感染感染 分离纯化分离纯化 二、 遗传物质存在的部位和方式质粒：凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子。质粒特点质粒特点： 从结构上看为超螺旋结构 从大小上看，相对分子质量为106108（相当核基因组的1） 从功能上看，质粒上存在核内没有的基因，赋予了原核生物并非必不可少的特殊功能，如：产毒、接合、抗药、固氮等。a)从存在形式上看，是一种复制子，分为严紧型复制（与核染色体的复制同步）与松弛型复制（不与核染色体的复制同步）。（二） 原核生物的质粒 少量质粒可在不同菌株间转移，如：F 因子或R因子等。有些质粒具有与核染色体 发生整合或脱离的功能，称附加体附加体.如F因 子。 此外，质粒还有基因重组功能，可在质粒间、质粒与核染色体之间发生基因重组。一些有代表性的质粒一些有代表性的质粒： F因子、R因子、Col质粒、Ti质粒、巨大质粒、Ti质粒。F因子：又称性因子，是E.coli等细菌决定性别的质粒，当然除E.coli外，亦发现其他菌也有此质粒。如假单胞菌属、链球菌属。有性菌毛的细菌体内均含性质粒，且性菌毛根数与性质粒数目相等（1-4），故属于松弛型。R因子：亦称抗药质粒、R质粒存在于细菌中，使菌体具有抗药性的质粒。最初是在痢疾杆菌中提取出来。Col质粒：又称大肠杆菌素质粒，许多细菌都能产生使其他原核生物抑制或致死的蛋白质类细菌毒素。大肠杆菌素都是由Col质粒编码。Ti质粒：亦称诱癌质粒主要存在于根癌菌株中，由Ti质粒引起植物的根癌。巨大质粒：比一般质粒大几十倍至几百倍。其他质粒：降解性质粒只存在于假单胞菌属，能够编码可降解复杂物质的酶类。 几个重要概念：基因突变：简称突变，是遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传性的变化，可自发或诱导产生。野生型菌株：从自然界分离到的菌株，简称野生型。突变株：即野生型经突变后形成的带有新性状的菌株。 第二节基因突变和诱变育种一、基因突变（一）突变类型根据突变的菌株能否在选择性培养基选择性培养基上加以鉴别，可分为：选择性突变和非选择性突变两大类。前者在选择性培养基上通过表型就可以区别开，主要有：营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型；后者在选择培养基上不能用表型区别开，主要有：形态突变型、抗原突变型、产量突变型。选择性突变 营养缺陷型：由于野生型基因发生突变，而丧失了合成某一种或某几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，无法在基本培养基上生长，此类菌株称为营养缺陷型。 抗性突变型：由于基因突变，野生型菌株产生了对某种理化因子抗性的突变类型。如一些抗生素抗药性菌株。条件致死突变型：菌株在基因突变后，在一定条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖，这类突变类型称为条件致死突变型。例如：某些T4噬菌体突变株在25 下可感染其宿主E.coli，而至37时却不能感染。非选择性突变形态突变型：指个体形态或群体形态因突变而与野生型不同。例如： S形菌落突变为R形菌落，鞭毛有无或荚膜有无的突变。抗原突变型：由于突变使抗原结构与野生型不同。如：细胞壁缺陷变异（如L型细菌）。产量突变型：通过基因突变而获得在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株。若产量显著高于原始菌株者称正突变，反之则称负突变。突变率：某一细胞（或病毒粒子）在某一世代中发生某一性状突变的几率。 如突变率为10-8表示细胞在1亿次分裂过程中，会发生1次突变。 突变是独立发生的，互相不影响，同一细胞中同时发生两个或两个以上突变的几率极低。 双重或多重突变的几率是各个基因突变几率的乘积。（二）突变率 自发性：是在没有人为干涉的条件下产生的突。 不对应性：指突变性状与引起突变的原因之间无直接的对应关系。 稀有性：一般突变尤其是自发突变，几率极小（几率为10-6-10-9）。 独立性：某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。 可诱变性：使用诱变剂，可显著提高突变几率，在遗传育种上较常用。 稳定性：突变后的新性状可以稳定地遗传给下一代。 可逆性：由野生型基因变异为突变型基因，称正向变异。由突变型基因返回到原始的野生型基因，称回复突变。（三） 突变的特点7个共同点：大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(在同一个大管中作整体培养)(培养前先分成50小管) 3 7 1 4 4 3 5 抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数涂布试验 涂布敏感菌5104个共12个平板5104个菌落5000个细菌/菌落6个平板共353个菌落 6个平板共28个菌落喷入T1保温重新涂布后 喷入T1保温结论：结论：该抗性突变发生在与噬菌体T1接触之前，噬菌体的加入只起到甄别该类自发突变是否发生、存在，决不是诱发该类突变的原因。原始敏感菌种影印培养无药培养基含药培养基结论：结论：对链霉素敏感的E.coli K12细胞在未接触过任何一点链霉素的条件下，由12456891012的移种可筛选出大量抗链霉素的突变株。( (五）基因突变的机制五）基因突变的机制 突变机制是多样性的，可以是自发的或诱发的，具体见下图。诱发突变：简称诱变，指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变几率的手段。1.1.诱变机制诱变机制诱变剂：能够提高突变几率的任何因素。碱基的置换 移码突变 染色体畸变 （1 1）碱基置换碱基置换 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变。嘌呤置换嘌呤（嘧啶置换嘧啶）嘌呤置换嘌呤（嘧啶置换嘧啶）转换转换嘌呤置换嘧啶或者嘧啶置换嘌呤嘌呤置换嘧啶或者嘧啶置换嘌呤颠换颠换 A.TA.TA.TG. CA.BU酮式G.BU烯醇式G. CA.BUG. BUA.BUG. CA.T烯醇式酮式（2 2）移码突变）移码突变 指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸增加或减少，从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架改变，引起转录和转译错误的一类突变。 移码突变属于DNA的轻微损伤，也是一种点突变，由移码突变所产生的突变株称为移码突变株。 移码突变的几种情况如下图示移码突变的几种情况如下图示 移码突变的结果：正常链上增加或是缺失1、2或4、5个碱基时，均可引起移码突变，而增加或缺失3或6个不影响读码，只引起较短的增加或缺失。（六）紫外线对（六）紫外线对DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复 二、突变与育种（一）自发突变与育种 从生产中育种 在利用微生物进行大生产的过程中，微 生物会以10-6左右的突变率自发突变，其中 可能出现一定几率正突变株。2)定向培育优良菌株。 利用自然突变，对微生物群体采用特定的选择条件选育出优良菌株。但总的来说，方法古老，自发突变的目的性不强，周期长。（二） 诱变育种 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，方法， 从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。（无目的的诱变，有目学实验或生产实践使用。（无目的的诱变，有目的的筛选）的的筛选）诱变育种的基本环节出发菌株计算出诱变大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产2 2、诱变育种应考虑的几个原则：、诱变育种应考虑的几个原则： 选择简便有效的诱变剂，如紫外线、激光和离子选择简便有效的诱变剂，如紫外线、激光和离子束，烷化剂、碱基类似物等。束，烷化剂、碱基类似物等。 艾姆斯试验艾姆斯试验(Ames test(Ames test）：是一种利用细菌）：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效的方法存在化学致癌剂的简便有效的方法. . 利用微生物营养缺陷型（利用微生物营养缺陷型（hishis）的回）的回复突变来检测环境或食品中化学致癌剂。（复突变来检测环境或食品中化学致癌剂。（“三三致致”致癌，致畸，致突变）致癌，致畸，致突变）艾姆斯试验艾姆斯试验(Ames test(Ames test）：是一种利用细菌营养缺陷）：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效的方法的简便有效的方法. . 利用微生物营养缺陷型（利用微生物营养缺陷型（hishis）的回复突变来检测）的回复突变来检测环境或食品中化学致癌剂。（环境或食品中化学致癌剂。（“三致三致”致癌，致畸，致突致癌，致畸，致突变）变）保温可疑“三致”试样 鼠肝匀浆（含羟化酶） 吸入滤纸片S.t.his阳性阴性S.t.his回变 挑选优良的出发菌株。挑选优良的出发菌株。 A.A.选生产中的自发突变菌株选生产中的自发突变菌株; ; B.B.已具有优良性状的菌株已具有优良性状的菌株; ; C.C.对诱变剂敏感性较高的菌株等。对诱变剂敏感性较高的菌株等。 处理单细胞或单孢子悬液。处理单细胞或单孢子悬液。目的：使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯目的：使每个细胞均匀接触诱变剂并防止长出不纯菌落。菌落。 选用最佳诱变剂量。选用最佳诱变剂量。紫外线的剂量指强度与作用时间之乘积紫外线的剂量指强度与作用时间之乘积; ;化学诱变化学诱变剂的剂量则以在一定外界条件下，诱变剂浓度与处理时间剂的剂量则以在一定外界条件下，诱变剂浓度与处理时间来表示。来表示。 充分利用复合处理的协同效应。充分利用复合处理的协同效应。该法包括同一诱变剂的重复使用，两种或多种诱变该法包括同一诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的先后或同时使用。剂的先后或同时使用。 利用和创造形态、生理与产量之间相关指标。利用和创造形态、生理与产量之间相关指标。 如淀粉水解试验，就是利用淀粉酶变色圈（用碘如淀粉水解试验，就是利用淀粉酶变色圈（用碘 液显色）的大小来估计突变代谢产物量的多少。液显色）的大小来估计突变代谢产物量的多少。 设计或创造高效筛选方案。设计或创造高效筛选方案。如在实际中，筛选工作常分为初筛和复筛两步进如在实际中，筛选工作常分为初筛和复筛两步进行。行。3 3、营养缺陷型突变株的筛选（重点）、营养缺陷型突变株的筛选（重点）1 1）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基 基本培养基（基本培养基（MMMM，-）：仅能满足某一微生物的野生）：仅能满足某一微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，（该培养型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基，（该培养基都是人工培养基，营养缺陷型菌株不能在其上生长）。基都是人工培养基，营养缺陷型菌株不能在其上生长）。 完全培养基（完全培养基（CMCM，+）：所有营养缺陷型菌株均可在）：所有营养缺陷型菌株均可在其上生长的培养基。其上生长的培养基。一般地，完全培养基是天然或半人工合成的。一般地，完全培养基是天然或半人工合成的。 补充培养基（补充培养基（SMSM，AA、BB或或ABAB）：凡只能满足相应）：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基2 2）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类遗传型个体）与筛选营养缺陷型突变株有关的三类遗传型个体 野生型：从自然界分离到的没有发生过任何野生型：从自然界分离到的没有发生过任何突变，可以在基本培养基上生长的菌株。突变，可以在基本培养基上生长的菌株。 营养缺陷型：野生型菌株因为突变，失去了合营养缺陷型：野生型菌株因为突变，失去了合成某种酶的能力，使得该酶产物不能产生，只能在成某种酶的能力，使得该酶产物不能产生，只能在加有这种产物的培养基上生长的菌株。加有这种产物的培养基上生长的菌株。该型不能在该型不能在-上生长，只能在上生长，只能在+或相应的补或相应的补充培养基上生长。该型非自身合成。充培养基上生长。该型非自身合成。 原养性：营养缺陷型经回变或其他的基因改原养性：营养缺陷型经回变或其他的基因改造，回复为与野生型相同的形状的菌株造，回复为与野生型相同的形状的菌株. .（与野（与野生型从现象上无任何区别。）生型从现象上无任何区别。）3 3）营养缺陷型的筛选方法）营养缺陷型的筛选方法 一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个步骤养缺陷型四个步骤 。u 步步 诱变剂处理诱变剂处理 ：与一般诱变处理相同：与一般诱变处理相同u 步步 淘汰野生型（即筛选出基因突变的类型），现举两种方法。淘汰野生型（即筛选出基因突变的类型），现举两种方法。A A抗生素法（最常用）。抗生素法（最常用）。 a a青霉素：抑制细胞壁肽聚糖的合成，故可杀青霉素：抑制细胞壁肽聚糖的合成，故可杀死生长、繁殖状态的细菌，对休眠状态的无用。死生长、繁殖状态的细菌，对休眠状态的无用。方法：将诱变后的菌培养到含青霉素的基本培养基上，方法：将诱变后的菌培养到含青霉素的基本培养基上，即野生型被淘汰，留下的为休眠状态的营养缺陷型。即野生型被淘汰，留下的为休眠状态的营养缺陷型。 b b制霉菌素：主要与真菌细胞膜上的甾醇作制霉菌素：主要与真菌细胞膜上的甾醇作用，引起膜损伤。用，引起膜损伤。方法：将诱变后的孢子培养到含制霉菌素的基本培方法：将诱变后的孢子培养到含制霉菌素的基本培养基上，基本培养基长出菌丝者为营养缺陷型。养基上，基本培养基长出菌丝者为营养缺陷型。 B B菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。可用大孔擦镜纸反复过滤筛选出。可用大孔擦镜纸反复过滤筛选出。 A A夹层培养法（夹层培养法（“三明治三明治”状）状） u步步 检出缺陷型检出缺陷型现举出四种方法：现举出四种方法：小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型） B B限量补充培养法限量补充培养法 在基本培养基上，加微量的天然成分（不同于补充培养基），在基本培养基上，加微量的天然成分（不同于补充培养基），营养缺陷型形成微菌落，而野生型形成正常大小的菌落。营养缺陷型形成微菌落，而野生型形成正常大小的菌落。微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株 C C逐个检出法逐个检出法 将诱变处理的细胞涂在含有完全培养基的平板，长将诱变处理的细胞涂在含有完全培养基的平板，长成菌落，再将其接种至基本培养基上不长菌落（为营养缺陷型）。成菌落，再将其接种至基本培养基上不长菌落（为营养缺陷型）。含诱变剂的液体培养基菌种涂布培养基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落营养缺陷型 D D影印平板影印平板法法完全培养基完全培养基影印接种基本培养基基本培养基将诱变处理的细胞涂不于含有完全培养基的平将诱变处理的细胞涂不于含有完全培养基的平板，长出菌落，利用影印接种工具将该菌落转移到板，长出菌落，利用影印接种工具将该菌落转移到另一个基本培养基上培养，亦长出菌落，将前后相另一个基本培养基上培养，亦长出菌落，将前后相应菌落对比，若前者生长，而后者不生长的菌落，应菌落对比，若前者生长，而后者不生长的菌落，为营养缺陷型（类似为营养缺陷型（类似“平板影印培养试验平板影印培养试验”）。）。u步步 鉴定缺陷型（采用生长谱法）鉴定缺陷型（采用生长谱法）生长谱法:指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物,视某营养物的周围有否长菌来确定供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。 操作：将营养缺陷型细胞（或孢子）洗下，用无菌水离心清洗，制成菌悬液并与基本培养基混合培养，用含有不同营养物的滤纸片覆盖，如某滤纸片周围有微生物生长圈，则为该营养物的营养缺陷型。该法优点：方法简便，不怕污染菌，回复突变细胞不影响结果，此方法又可测定双重或多重营养缺陷型。（二）转导转化与转导的区别：转化：受体菌直接接受供体菌DNA片段。转导：受体菌通过噬菌体接受供体菌DNA片段。供体A-B+A+B-多数受体形成溶源菌A-B+A+B-少数受体A+B+经重组形成转导子A-B+色氨酸缺陷型A+B-组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌通过细胞间的直接接触能进行大通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合段的转移的过程，叫接合 接 合 及 其 发 现+A+B+C-D- A-B-C+D+ A+B+C+D+原生质体融合原生质体融合(protoplast fusion)(protoplast fusion)基因工程菌种保藏方法