水处理微生物学1-6

会计学1水处理微生物学水处理微生物学1-6生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程质变过程。在高等生物高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。微生物生长繁殖的相关概念微生物生长繁殖的相关概念 发育：发育：微生物的生长与繁殖是个交替过程，从生长微生物的生长与繁殖是个交替过程，从生长到繁殖的量变到质变的过程是发育。到繁殖的量变到质变的过程是发育。 一般微生物的研究和应用中，只有群体的生一般微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义，所以通常讲的长才有意义，所以通常讲的“生长生长”是指群体生长是指群体生长。一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长一般，原核微生物的繁殖速度大于真核微生物。好氧微一般，原核微生物的繁殖速度大于真核微生物。好氧微生物快于厌氧微生物。生物快于厌氧微生物。n 2. 2.世代时间世代时间第一节第一节 微生物的纯培养微生物的纯培养一、纯培养的定义一、纯培养的定义 微生物在自然界中都是混杂地生活在一起。要想研究微生物在自然界中都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一种微生物，必须把它众混杂的微生物类群分或利用某一种微生物，必须把它众混杂的微生物类群分离出来，以得到只含有一种微生物的培养。离出来，以得到只含有一种微生物的培养。 微生物学中将在实验条件下，从一个细胞或同种细胞微生物学中将在实验条件下，从一个细胞或同种细胞群繁殖得到的后代称为群繁殖得到的后代称为纯培养纯培养。二、纯培养的分离方法二、纯培养的分离方法 平板划线分离法平板划线分离法 稀释倒平板法稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法单孢子或单细胞分离法 利用选择性培养基分离法利用选择性培养基分离法（一）平板划线分离法（一）平板划线分离法 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。 （二）稀释倒平板法（二）稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如10、100、1000、10000倍倍），然后分别取不同稀释液少许，），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至与已溶化并冷却至45左右的琼脂培养基混合，摇匀后，左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。稀释得当，琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。（三）单孢子或单细胞分离法（三）单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个孢子进行培养以获得纯培养。孢子进行培养以获得纯培养。 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的的 微生物如藻类、原生动物容易，个体较小的细菌较难。微生物如藻类、原生动物容易，个体较小的细菌较难。 对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。研究中采用。（四）利用选择性培养基分离法（四）利用选择性培养基分离法各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。得纯培养。另外，还可以将样品预处理，消除不希望分离到的微生另外，还可以将样品预处理，消除不希望分离到的微生物。如加温杀死营养菌体而保留芽孢，过滤去除丝状菌体物。如加温杀死营养菌体而保留芽孢，过滤去除丝状菌体而保留单孢子。而保留单孢子。 微生物纯培养分离方法的比较微生物纯培养分离方法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法适用于分离某些生理类型较特殊的微生物直接法间接法测体积称干重含氮量生理指标法（耗氧量，酶活性等）计数器计数法电子计数器计数法涂片染色法直接法间接法液体稀释法平板菌落计数法比浊法三、微生物生长繁殖的测定方法三、微生物生长繁殖的测定方法1、 生理指标法生理指标法微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显，因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。常用于对微生物的快速鉴定与检测常用于对微生物的快速鉴定与检测2、计数器计数法、计数器计数法缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；3、平板菌落计数法、平板菌落计数法样品充分混匀；每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液；同一稀释度三个以上重复,取平均值；每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数；一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数。4、液体稀释法主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。5、比浊法、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。一、培养方法一、培养方法n分批培养：分批培养：将少量细菌接种于一定量的液体培养基将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌数目或重量的变化数目或重量的变化。n连续培养：连续培养：流入新鲜培养基的同时不断流出培养物流入新鲜培养基的同时不断流出培养物的培养方式，即的培养方式，即一方面连续进料，另一方面又连续一方面连续进料，另一方面又连续出料的培养方式出料的培养方式第二节第二节 微生物的生长曲线微生物的生长曲线典型生长曲线，只适用于单细胞微生物如细菌和酵母菌，对于典型生长曲线，只适用于单细胞微生物如细菌和酵母菌，对于丝状生长的真菌或放线菌，只能获得非典型的生长曲线丝状生长的真菌或放线菌，只能获得非典型的生长曲线典型生长曲线典型生长曲线细分：细分：停滞期(适应期)、加速期、对数期、减速期、静止期、衰 亡期粗分：粗分：停滞期(适应期)、对数期、静止期、衰亡期。1. 停停滞期滞期适应环境（合成相应的酶）适应环境（合成相应的酶）营养储备（用于复制合成）营养储备（用于复制合成）“万事开头难万事开头难”（一）特点（一）特点 生长速率常数等于零生长速率常数等于零 细胞形态变大或增长细胞形态变大或增长 细胞内细胞内RNA尤其是尤其是rRNA含量增高，含量增高， 原生质呈嗜碱性原生质呈嗜碱性 合成代谢活跃合成代谢活跃 对外界不良条件反应敏感对外界不良条件反应敏感（二）影响停滞期长短的因素（二）影响停滞期长短的因素2. 指数期指数期又称对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一又称对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。（一）特点（一）特点 生长速率常数生长速率常数R R最大，因而细胞每分裂一次所需的代最大，因而细胞每分裂一次所需的代 时时G G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；或原生质增加一倍所需的倍增时间最短； 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀； 酶系活跃，代谢旺盛。酶系活跃，代谢旺盛。指数期的微生物可作为代谢、生理等研究的良好材料，指数期的微生物可作为代谢、生理等研究的良好材料，是发酵生产中用作是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄。的最佳种龄。 （二）指数生长公式（二）指数生长公式 N Nx x= N= N0 02 2n n LgN LgNx x=lgN=lgN0 0+nlg2+nlg2 n = n =（lgNlgNx x-lgN-lgN0 0 )/lg2 =(lgN)/lg2 =(lgNx x-lgN-lgN0 0)/0.301)/0.301 G = G = (t (tx x-t-t0 0)/n )/n t0 txNX N0（三）影响指数期的因素（三）影响指数期的因素菌种：菌种： 不同菌种的代时差异极大不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率培养温度：影响微生物的生长速率 是代谢、生理研究的良好材料是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄的最佳种龄 G G染色鉴定时采用此期微生物染色鉴定时采用此期微生物（四）指数期的应用（四）指数期的应用3. 稳定期稳定期( (一一) ) 特点特点n形成糖原、异染颗粒等贮藏物n多数芽孢杆菌开始形成芽孢n有的微生物开始合成抗生 素等次生代谢产物（二）稳定期到来的原因（二）稳定期到来的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，例如CN比值不合适等； 有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。 （三）稳定期的应用（三）稳定期的应用（一）特点（一）特点4.4.衰亡期衰亡期营养物耗尽营养物耗尽有毒代谢物积累有毒代谢物积累（二）衰亡期的原因（二）衰亡期的原因与菌种的遗传特性有关与菌种的遗传特性有关: : 有些细菌的培养经历所有的各有些细菌的培养经历所有的各 个生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至个生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至 几年以后仍然有一些活的细胞；几年以后仍然有一些活的细胞；与营养物质和有毒物质有关与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中：补充营养和能源，以及中 和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细 菌培养物的存活时间。菌培养物的存活时间。（三）影响衰亡期的因素（三）影响衰亡期的因素两种连续培养方式：两种连续培养方式：n恒浊连续培养恒浊连续培养n恒化连续培养恒化连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的使菌体维持最高的生长速率。生长速率。1.1.恒浊连续培养恒浊连续培养设备：恒化器设备：恒化器n是一种以恒定流速进水，以相同速率流出代谢产物，使细菌始终在低于其最高生长速率条 件下进行生长繁殖的一种 连续培养装置。n通过控制某一种营养物的 浓度，使其始终成为生长 限制因子的条件下达到的。2.2.恒化连续培养恒化连续培养在连续培养中，微生物的生长状态和规律与分批在连续培养中，微生物的生长状态和规律与分批培养不同，往往是处在相当于分批培养中生长曲线培养不同，往往是处在相当于分批培养中生长曲线的某一生长阶段。的某一生长阶段。 如：废水生物处理的连续运行过程中，活性污泥如：废水生物处理的连续运行过程中，活性污泥中的微生物处在相当于分批培养生长曲线的生长阶中的微生物处在相当于分批培养生长曲线的生长阶段：加速期或对数期，或静止期或衰亡期段：加速期或对数期，或静止期或衰亡期3.3.连续培养微生物的生长规律连续培养微生物的生长规律对数期静止期衰亡期n1.细菌典型生长曲线是什么细菌典型生长曲线是什么?不同时期的特不同时期的特点及影响因素是什么？点及影响因素是什么？n2.细菌生长曲线在废水生物处理中的应用细菌生长曲线在废水生物处理中的应用及原理是什么？及原理是什么？（二）稀释倒平板法（二）稀释倒平板法 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如10、100、1000、10000倍倍），然后分别取不同稀释液少许，），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至与已溶化并冷却至45左右的琼脂培养基混合，摇匀后，左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。稀释得当，琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。4、液体稀释法主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物。对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算出样品中的微生物数目。5、比浊法、比浊法在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度(optical density, 即O.D.)表示菌量。实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。 是代谢、生理研究的良好材料是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作是发酵生产中用作“种子种子”的最佳种龄的最佳种龄 G G染色鉴定时采用此期微生物染色鉴定时采用此期微生物（四）指数期的应用（四）指数期的应用（二）稳定期到来的原因（二）稳定期到来的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，例如CN比值不合适等； 有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。 （三）稳定期的应用（三）稳定期的应用设备：恒化器设备：恒化器n是一种以恒定流速进水，以相同速率流出代谢产物，使细菌始终在低于其最高生长速率条 件下进行生长繁殖的一种 连续培养装置。n通过控制某一种营养物的 浓度，使其始终成为生长 限制因子的条件下达到的。2.2.恒化连续培养恒化连续培养n1.细菌典型生长曲线是什么细菌典型生长曲线是什么?不同时期的特不同时期的特点及影响因素是什么？点及影响因素是什么？n2.细菌生长曲线在废水生物处理中的应用细菌生长曲线在废水生物处理中的应用及原理是什么？及原理是什么？