电泳影响因素.docx

在电泳过程中，带电粒子的移动速度v除与粒子所带电荷量Q及电场强度X有关外，还与 粒子半径r及介质的粘度n有关：v=QX/6nrq上式中，6门是适用于球形带电粒子的经验数值，对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不 同。可见，带电粒了的移动速度和粒了的本身的性质有密切关系，粒了表面所带电荷量和物 质的组成结构有密切关系。此外，粒子的大小（分子量）及粒子的形状等也有重要的影响。 所以，在一定电场强度下，不同种类的带电物质在电泳时的移动速度就不能完全一致，这种 移动速度的差异就是电泳技术的基本依据。1. 样品带电化合物的性质在几个方面影响着它们的迁移率。（1）电荷：迁移率随净电荷的增加而增加。电荷的大小一般由pH决定。（2）分子大小：对于较大的分子，由于周围介质所引起的摩擦力和静电力的增加，迁移率 下降。（3）形状：同样大小的，但是具有不同形状的分子，如纤维状的蛋白质和球状蛋白质，因 摩擦力作用不同，而表现有不同的迁移特征。2. 电场欧姆定律表示了电流A （安培）、电压V （伏特）和电阻Q （欧姆）之间的关系：A=V/Q 因此，离子在电场中的分离受到这三个因素的影响。（1）电流：由于在二个电极之间溶液中的电流完全由缓冲液和样品的离了来传导，因此, 迁移率与电流成正比。离子迁移的距离与通电时间成正比。因此，为了得到最好的重复性, 在电泳时电流必须保持恒定。当然必须使用直流电。（2）电压：电压控制着电流，因此，迁移率与加在支持介质两端的电位差成正比。这是电 压梯度，一般用伏特/厘米（V/cm）来表示（即，所加的电压除以支持介质的长度）。可 以使用低电压（100-500伏），或者高电压（500-10,00。伏），电压梯度分别可达 20和200伏/厘米。高电压主要是用于分离小分子的化合物。（3）电阻：迁移率与电阻成反比，电阻由支持介质的类型和大小，以及缓冲液的离子强度 所决定。电阻随支持介质的长度而增加，随支持介质的宽度和缓冲液离子强度的增加而降低。 在电泳时以A2Q瓦特的比率产生热，并且电阻随温度升高而下降。因此，如果电压保持不 变，那么这种温度的升高将会引起电流的升高，并且促使了支持介质上溶剂的蒸发。为了尽 可能得到可重复的结果，使用经过稳定的电源装置，尽管由于温度的波动，不可避免地会引 起电阻的改变，但是这种电源能自动地保持电压或者电流的恒定。用一个密闭的盖子罩住电 泳槽以减少蒸发。在电泳槽中附设一个冷却系统，在高压工作时起到外加冷却的作用。3. 缓冲液缓冲液决定着并稳定着支持介质的pH,并且通过很多途径也影响着化合物的迁移率。（1）成分：通常所用的缓冲液是甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐和磷酸盐、Tris、 EDTA和毗喘。硼酸缓冲液经常用于碳水化合物的分离，因为它们能和碳水化合物产生带电 的复合物。因为缓冲液是样品的溶剂，因此，不可避免的会有一定强度的样品扩散。特别值得注意的是 像氨基酸和糖-类的小分了。让样品走成很窄的带，避免过量的加样：在-个尽可能短的时 间内使用高电压；以及在分离完成后迅速地取出并干燥等都能缩小扩散的适度。（2）浓度：由于缓冲液离子强度的增加，缓冲液所栽的分电流也随之增加，样品所载的电 流则降低，因此而减缓了样品的迁移率。增加缓冲液的离子强度也增加了总电流，因而增加 了热的产生。在低离子强度时，缓冲液所载的电流下降，样品所载的电流增加，因此加速了样品的迁移。 低离子强度的缓冲液降低了总电流，结果减少了热的产生，但是扩散较严重，使分辨力明显 的降低。所以，选择离子强度时必须两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02-0.2之间。离子 强度= CZ21Z2, C是离子的克分子浓度，Z是它所带的电荷。（3）pH：像无机盐那样的完全离子化的化合物，pH的作用不大。但是对于有机化合物, pH决定了它的电离程度。有机酸的电离随pH的增加而增加，有机碱则相反；因此，它们 的迁移程度由pH决定。对于像氨基酸一类既有碱性也有酸性的化合物（两性电解质），两 种作用都有。因此，两性电介质迁移的方向以及迁移的程度由pH决定，根据分离的需要可以使用pH从 1一 11范围内的缓冲液。在两个蓄水槽中的缓冲液一般是相同的，用来饱和支持介质，但是，在凝胶电泳中，缓冲液 是支持介质的一部分，因此，在凝胶中经常使用一种与缓冲液槽中不相同的缓冲液。这样能 使电泳得到很好的分辨率。4. 支持介质虽然使用了比较惰性的材料作为支持介质，但是介质的精确结构对一种化合物的迁移率有很 多影响，而对介质的选择取决于所用的样品类型。（1）吸附：正如吸附层析一样，这是支持介质对样品分子的滞留作用。它导致了样品的拖尾，使样品的 移动像个彗星，不能形成条很清晰的带，因而降低了分离的分辨率。吸附也降低了总的 迁移率。纸的吸附最大，但使用醋酸纤维素实际上可以消除这种作用。（2）电渗（电内渗）：这种现象是由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的种相关电荷引起的。由于支 持介质中基团的电离作用以及对缓冲液离子的表面吸附作用，通常由水分子产生水合氢离子 （H3O+）。由于这些离子是带正电荷的。因此它们带着溶解的中性物质移向阴极，加速 了阳离子的前进、而阻滞了阴离子的移动。这种作用一般可以忽略不计，但是，如果在测定 化合物的等电点时，这种作用必须被考虑，一般通过对一种中性的分子（如腕或葡萄糖）进 行电泳，测定它们迁移的程度来决定。醋酸纤维素或聚丙烯酰胺凝胶的电渗作用没有纸或淀 粉胶那么明显。（3）分子筛：这是凝胶电泳的一个特性。在这种电泳中，半刚性支持介质（凝胶）的分子筛特性有助于蛋 白质一类不但在电泳移动率方面有所区别，而且在大小、形状上也有所不同的大的离子化合 物的分离。凝胶是由分布于整个凝胶的自由缠绕的分子链组成，这些分子链使凝胶成为-种筛样的结构。凝胶的孔径可以在定的范围内有所不同，而使之适合于特殊的分析。琼 脂、淀粉和聚丙烯酰胺凝胶的分子筛原理是，大分子的移动随凝胶中交联度的增加，孔径的 减少，而阻力逐渐增加。如果使用Sephadex型的凝胶，情况正相反，因为它的特性对丁 小分子迁移的阻碍作用要比大分子来得大。