蛋白质工程设计

小组成员：雷文丽小组成员：雷文丽 李亚李亚 刘苗刘苗 蛋白质工程蛋白质工程第三节第三节 天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的剪裁第四节第四节 全新蛋白质设计全新蛋白质设计在分子设计的实践中，常依据改造部位的在分子设计的实践中，常依据改造部位的多少将分子设计分为三类：多少将分子设计分为三类：1定点突变或化学修饰法定点突变或化学修饰法（小改）（小改） 置换、删除或插入氨基酸，依赖分子置换、删除或插入氨基酸，依赖分子生物技术，是目前最广泛使用的方法生物技术，是目前最广泛使用的方法2拼接组装设计法拼接组装设计法（中改）（中改）当前主要从基因水平上完成，又称当前主要从基因水平上完成，又称“分子分子裁剪裁剪”3从头设计全新蛋白质从头设计全新蛋白质（大改）（大改）从基因水平上，或直接进行化学全合成从基因水平上，或直接进行化学全合成 第三节第三节 天然蛋白质的剪裁天然蛋白质的剪裁方法：方法：1、将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一将编码一种蛋白质的部分基因移植到另一种蛋白质基因上种蛋白质基因上2、将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。基因克隆和表达，产生出新的融合蛋白质。 应用应用 1、嵌合抗体、嵌合抗体 利用基因工程的方法对鼠源单克隆抗体进行利用基因工程的方法对鼠源单克隆抗体进行改造使其人源化，鼠源抗体的改造使其人源化，鼠源抗体的V区与人源抗体的区与人源抗体的C区进行拼接形成人区进行拼接形成人-鼠嵌合抗体。鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原型；特点：减少了鼠源性抗体的免疫原型； 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。 2 2、人改型抗体、人改型抗体 将鼠单抗的将鼠单抗的CDRCDR移植到人单抗的骨架区。移植到人单抗的骨架区。 结构与功能的容忍度结构与功能的容忍度 蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的蛋白质结构及功能对残基的替换有一定的容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度容忍度，即结构与功能关系有一定的稳健度 FershtFersht等替换了等替换了BarnaseBarnase的所有内核残基。的所有内核残基。结果表明结果表明2323的突变体保留了酶的活性的突变体保留了酶的活性 MathewsMathews及其合作者在溶菌酶内核中替换及其合作者在溶菌酶内核中替换多至多至1010个残基。实验证明多重取代的蛋白仍个残基。实验证明多重取代的蛋白仍具有活性以及协同折叠具有活性以及协同折叠 这些结果说明不同的氨基序列具有相近这些结果说明不同的氨基序列具有相近的设计的结构的设计的结构 第四节第四节 蛋白质分子的全新设计蛋白质分子的全新设计 全新蛋白质设计全新蛋白质设计：指基于对：指基于对蛋白质折叠规律的认蛋白质折叠规律的认识，从氨基酸的序列出发识，从氨基酸的序列出发，设计制造自然界不存在的，设计制造自然界不存在的全新蛋白质全新蛋白质使之具有使之具有特定的空间结构和预期的功能。特定的空间结构和预期的功能。蛋白质全新设计流程蛋白质全新设计流程设计目标设计目标序列生成序列生成结构预测结构预测结构模型结构模型基因克隆、多肽合成基因克隆、多肽合成全新蛋白质或多肽全新蛋白质或多肽结构功能预测结构功能预测 蛋白质的全新设计内容：蛋白质的全新设计内容：1）蛋白质结构的从头设计）蛋白质结构的从头设计-二级结构二级结构2）蛋白质功能的从头设计）蛋白质功能的从头设计-天然蛋白质功能的模拟天然蛋白质功能的模拟 根据稳定不同类型蛋白质的相互作用力来设计根据稳定不同类型蛋白质的相互作用力来设计不同类型的蛋白质，且已取得了明显进展，例如，不同类型的蛋白质，且已取得了明显进展，例如，离子通道纳米管、血红素结合蛋白、离子通道纳米管、血红素结合蛋白、 氧化还原活氧化还原活性蛋白质、性蛋白质、DNADNA结合蛋白及基于蛋白质的高分子材结合蛋白及基于蛋白质的高分子材料。料。蛋白质从头设计概念 从头设计：根据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。 蛋白质结构的设计蛋白质结构的设计1、二级结构模块单元的自组装、二级结构模块单元的自组装2、配体诱导自组装、配体诱导自组装3、通过共价交叉连接实肽的自组装、通过共价交叉连接实肽的自组装4、在合成模板上肽的自组装、在合成模板上肽的自组装5、线性多肽折叠为球状结构、线性多肽折叠为球状结构6、基于基因库的全新蛋白质设计、基于基因库的全新蛋白质设计 一、蛋白质结构的从头设计一、蛋白质结构的从头设计 螺旋是通过氢键达到结构稳定的，单一螺旋是通过氢键达到结构稳定的，单一螺旋在螺旋在溶液中是稳定的。溶液中是稳定的。螺旋设计使用的策略有：螺旋设计使用的策略有：1 1）使用大的）使用大的形成螺旋倾向性的残基形成螺旋倾向性的残基，如亮氨酸、谷，如亮氨酸、谷氨酸或赖氨酸等氨酸或赖氨酸等2 2）使用）使用合适的集团合适的集团去除端基电荷，防止与螺旋偶极去除端基电荷，防止与螺旋偶极不合适的电荷相互作用不合适的电荷相互作用3 3）使用极化或荷电氨基酸）使用极化或荷电氨基酸引入稳定的氢键引入稳定的氢键或在螺旋或在螺旋中相隔一圈残基间的离子相互作用中相隔一圈残基间的离子相互作用4 4）使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的（脂肪的）使用在螺旋中相隔一圈的残基间疏水的（脂肪的或芳香的）或芳香的）范德华范德华相互作用相互作用5 5）使用）使用芳香芳香- -荷电或芳香荷电或芳香- -硫硫的相互作用的相互作用螺旋：螺旋： 1 1、二级结构模块单元的自组装、二级结构模块单元的自组装 最简单、最直接的策略：合成单一二级结构单元最简单、最直接的策略：合成单一二级结构单元（螺旋或螺旋或折叠股）作为多肽链的片段模块途径，复折叠股）作为多肽链的片段模块途径，复制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。制这些二级结构片段并把它们连接为整个蛋白质结构。优点：无论是从设计或合成看，都是简单的；容易合成优点：无论是从设计或合成看，都是简单的；容易合成缺点：蛋白质的稳定性（熵较大，依赖浓度）；结构的缺点：蛋白质的稳定性（熵较大，依赖浓度）；结构的简单重复简单重复+两条肽链自组装为有序的二聚体结两条肽链自组装为有序的二聚体结构构 螺旋螺旋 最简单的在自然界观察得到的最简单的在自然界观察得到的螺旋结构是螺旋结构是coiled-coilcoiled-coil以及四螺旋束。以及四螺旋束。coiled-coil：Hodges及其合作者设计（周期及其合作者设计（周期性重复七肽性重复七肽） （a）（b）（c）DeGradoDeGrado及其合作者通过逐渐增长的方法设计、合成的四螺旋束及其合作者通过逐渐增长的方法设计、合成的四螺旋束蛋白质蛋白质（a a）1616个残基的肽形成二聚体个残基的肽形成二聚体（b b）3232个残基的肽形成的四螺旋束个残基的肽形成的四螺旋束（c c）通过分子内折叠形成的）通过分子内折叠形成的7474残基的蛋白质残基的蛋白质四螺旋束四螺旋束 coiled-coilcoiled-coil和螺旋束差别：和螺旋束差别：共同之处：均为两亲性螺旋共同之处：均为两亲性螺旋不同点：不同点：coiled-coilcoiled-coil含有一个狭窄的疏水面（疏水残含有一个狭窄的疏水面（疏水残基主要在基主要在7 7肽序列肽序列a a和和d d位置），而螺旋束含有较宽的疏位置），而螺旋束含有较宽的疏水面水面 2 2、配体诱导组装、配体诱导组装 使用一个使用一个配体配体（典型的是一个金属离子）诱导模（典型的是一个金属离子）诱导模块蛋白片段的组装。块蛋白片段的组装。 配体诱导组装配体诱导组装 3 3通过通过共价交叉连接共价交叉连接实现肽的自组装实现肽的自组装 设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当设计全新蛋白的主要障碍是肽链的构象熵。当几个没有连接的肽链进行自助装时，熵势垒比较难几个没有连接的肽链进行自助装时，熵势垒比较难以克服。通过共价交叉连接可以减少构象熵。以克服。通过共价交叉连接可以减少构象熵。 被共价交叉连接所稳定的结构的组装被共价交叉连接所稳定的结构的组装 在自然界中唯一用于交叉连接的方法是二硫键。在自然界中唯一用于交叉连接的方法是二硫键。在全新蛋白设计中也使用其他种类的交叉连接。例在全新蛋白设计中也使用其他种类的交叉连接。例如如BetabellinBetabellin的设计中使用的的设计中使用的DABDAB交叉连接方法，虽交叉连接方法，虽然然DABDAB是二价的，但是是二价的，但是DABDAB是非极性的，它会减少是非极性的，它会减少BetabellinBetabellin在溶液中的溶解度，为此，二硫键连接在溶液中的溶解度，为此，二硫键连接代替代替DABDAB的交叉连接，得到的交叉连接，得到Betabellin14DBetabellin14D。 在合成模板上肽的组装在合成模板上肽的组装 是一种模板组装合成蛋白方法，不使用天然蛋是一种模板组装合成蛋白方法，不使用天然蛋白中的白中的turnturn和和loopsloops连接二级结构单元，而是使用连接二级结构单元，而是使用人工模板人工模板。同天然线性蛋白质不同，。同天然线性蛋白质不同，螺旋和螺旋和折折叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。叠股在一个特殊折叠过程有一个正确的相对取向。 MutterMutter研究组使用的模板是寡肽，可形成两个研究组使用的模板是寡肽，可形成两个反平行反平行折叠股，通过一个在一端的折叠股，通过一个在一端的Pro-GlyPro-Gly转折转折和一个在另一端的二硫键形成两个反平行的和一个在另一端的二硫键形成两个反平行的折叠折叠股，在链的两端设计一个二硫键，形成一个环状结股，在链的两端设计一个二硫键，形成一个环状结构。构。 5 5、线性多肽折叠为球状结构、线性多肽折叠为球状结构 不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球不用模板或交叉连接而通过线性多肽折叠成球形的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一。形的确定的三维结构是蛋白质设计追求的目标之一。主要障碍：构象熵主要障碍：构象熵 基于组合库的全新蛋白质设计基于组合库的全新蛋白质设计组合库设计的核心问题：埋藏疏水部分组合库设计的核心问题：埋藏疏水部分常用方法：基于极性（常用方法：基于极性（P P）和非极性（）和非极性（N N）氨基酸的）氨基酸的 “二元模式二元模式”，“二元模式二元模式”一方面要一方面要 有利于形成二级结构，另一方面又要埋有利于形成二级结构，另一方面又要埋 藏疏水残基。藏疏水残基。应用：二级结构两亲片断的构建（一面完全是极性应用：二级结构两亲片断的构建（一面完全是极性 残基，另一面完全是非极性残基）。残基，另一面完全是非极性残基）。 利用组合库方法寻找全新蛋白质已在如下方面利用组合库方法寻找全新蛋白质已在如下方面取得成功：取得成功：螺旋；螺旋；折叠片；单体；自组装为有折叠片；单体；自组装为有序的排列；堆积为天然类蛋白质；超热稳定性；结序的排列；堆积为天然类蛋白质；超热稳定性；结合辅因子的能力；催化活性。合辅因子的能力；催化活性。 二、蛋白质的功能设计二、蛋白质的功能设计 蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结蛋白质设计的目标是产生既能折叠为预想的结构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键构又具有有趣和有用的功能。功能设计主要涉及键合及催化，达到这一目的，可以采用两条不同的途合及催化，达到这一目的，可以采用两条不同的途径：径：1、反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；、反向实现蛋白质与工程底物的契合，改变功能；2、从头设计功能蛋白质。、从头设计功能蛋白质。蛋白质的功能设计通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能键合及催化的从头设计在全新蛋白质中引入结合位点催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计 通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合执行特别生物功能的天然蛋白质能通过反向拟合获得新的活性。通过修饰天然结构得到专一性及活性改获得新的活性。通过修饰天然结构得到专一性及活性改变的天然蛋白质是可能的，目前在以下范围已取得成功：变的天然蛋白质是可能的，目前在以下范围已取得成功：DNADNA结合专一性；改变辅因子的专一性；改变底物的专结合专一性；改变辅因子的专一性；改变底物的专一性。一性。 反向拟合的能力大于仅仅改变专一性的修饰。事反向拟合的能力大于仅仅改变专一性的修饰。事实上，它能把新奇的性质附加到原蛋白质骨架的结构上。实上，它能把新奇的性质附加到原蛋白质骨架的结构上。实例有：实例有：1）引入金属结合位点）引入金属结合位点2）位点专一）位点专一DNA裂解裂解 键合及催化的从头设计键合及催化的从头设计(A) 23个氨基酸自动折叠成的锌指结构（5）的核磁共振（NMR）结构(Struthers et al., 1996, 1998)；(B) 5同源四聚体衍生物T2的X-射线结构（Ali et al., 2004)；(C) T2异源四聚体衍生物hetT1的X-射线结构 (Ali et al., 2005).结构域替换结构域替换寡聚化策略寡聚化策略异源专一性异源专一性的计算机重的计算机重新设计新设计型异源四聚体的设计历程型异源四聚体的设计历程 在全新蛋白质中引入结合位点在全新蛋白质中引入结合位点 全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外，全新蛋白质设计除了能折叠为预想的结构外，还要设计新的结合位点（金属位点、血红素结合还要设计新的结合位点（金属位点、血红素结合位点等）及催化性质。位点等）及催化性质。新的金属结合位点 催化活性蛋白质的设计催化活性蛋白质的设计 这类设计的早期代表性工作是这类设计的早期代表性工作是ChymohelizymeChymohelizyme及及HelichromeHelichrome。两个设计蛋白质的催化位点与天然。两个设计蛋白质的催化位点与天然酶类似，在酶类似，在ChymohelizymeChymohelizyme中设计的活性位点，是中设计的活性位点，是模拟胰凝乳蛋白酶在模拟胰凝乳蛋白酶在HelichromeHelichrome中的卟啉环类似于中的卟啉环类似于血红素蛋白的活性位点。两个设计均使用人工交叉血红素蛋白的活性位点。两个设计均使用人工交叉连接预组织结构并使活性口袋的位置接近催化活性连接预组织结构并使活性口袋的位置接近催化活性部分。部分。 后来又设计了人工脱羧酶（后来又设计了人工脱羧酶（ART-OADART-OAD） 放置一个赖氨酸在两亲螺旋极面上并非常接近放置一个赖氨酸在两亲螺旋极面上并非常接近其他赖氨酸链，使中心的赖氨酸作亲核试剂，支架其他赖氨酸链，使中心的赖氨酸作亲核试剂，支架上的赖氨酸是荷正电能与荷负电的底物成键。上的赖氨酸是荷正电能与荷负电的底物成键。CDCD谱谱以及以及NMRNMR谱研究表明，谱研究表明，螺旋占优势。它的二级结构螺旋占优势。它的二级结构依赖于浓度，表明两亲螺旋的组装体为期望的多聚依赖于浓度，表明两亲螺旋的组装体为期望的多聚体（可能是四聚体）。它的体（可能是四聚体）。它的KmKm（14mmol/L)14mmol/L)类似于天类似于天然酶（然酶（Km=4mmol/L)Km=4mmol/L)。合成肽的。合成肽的KcatKcat（0.4min0.4min ）比天然酶慢比天然酶慢5 5个数量级但仍比脱羧反应快个数量级但仍比脱羧反应快900900倍。倍。 5 5、膜蛋白及离子通道的设计、膜蛋白及离子通道的设计 一个全新膜蛋白从一个不溶于水的聚集体转化一个全新膜蛋白从一个不溶于水的聚集体转化为类似于膜的环境要求构象变化。为类似于膜的环境要求构象变化。 MontalMontal等设计了一系列模拟天然离子通道特征等设计了一系列模拟天然离子通道特征的全新蛋白质，这些合成的微孔蛋白质称为的全新蛋白质，这些合成的微孔蛋白质称为SynporinSynporin，是使用，是使用MntterMntter的模板模拟方法。的模板模拟方法。4 4条相条相同的同的2323肽肽螺旋被固定在载体模板上，并且相互平螺旋被固定在载体模板上，并且相互平行。行。 SynporinSynporin结构结构 CD CD谱研究结果表明，谱研究结果表明，101101个残基的个残基的SynporinSynporin主主要是要是螺旋。形成的离子通道具有如下特点：单螺旋。形成的离子通道具有如下特点：单通道；能区别不同的阳离子；在毫秒时间范围内通道；能区别不同的阳离子；在毫秒时间范围内打开与关闭；对局部麻醉通道阻塞剂是敏感的。打开与关闭；对局部麻醉通道阻塞剂是敏感的。LearLear等设计并合成了含有简单两亲等设计并合成了含有简单两亲螺旋的离子螺旋的离子通道，其具有的特点是：序列与天然离子通道序通道，其具有的特点是：序列与天然离子通道序列不同；不用模板，是通过自组装形成围绕一个列不同；不用模板，是通过自组装形成围绕一个中心亲水孔的多聚体。中心亲水孔的多聚体。 6、新材料的设计、新材料的设计 自组装是构筑新材料的重要方法，是材料科学自组装是构筑新材料的重要方法，是材料科学与蛋白质折叠的共同的课题。与蛋白质折叠的共同的课题。GhadiriGhadiri等设计并利等设计并利用了多肽模块自组装成中空纳米管的新材料，采取用了多肽模块自组装成中空纳米管的新材料，采取的是平面环形构象。在中性情况下，谷氨酸侧链荷的是平面环形构象。在中性情况下，谷氨酸侧链荷负电，同时环肽彼此排斥，但在酸性情况下，酸性负电，同时环肽彼此排斥，但在酸性情况下，酸性基团质子化并形成平面分子间的氢键，替代了环肽基团质子化并形成平面分子间的氢键，替代了环肽间的排斥。因此介质的酸化导致环肽的自组装。间的排斥。因此介质的酸化导致环肽的自组装。