木聚糖酶出发菌株LXY的筛选及产酶条件

木聚糖酶出发菌株LXY-8的筛选及产酶条件考察许海艳，卢衍花，张志云，李永胜，杨翔华*（辽宁石油化工大学环境与生物工程学院；辽宁抚顺，113001）摘要：从近200份样品中分离筛选出酶活较高的木聚糖酶菌株LXY-8，经形态特征、生理生化鉴定其为根霉属。产酶最适条件为：温度30；木聚糖酶起始pH 4.6，纤维素酶初始pH 5.0；在pH27范围内，残余酶活保持在80%以上；Mg2+、Co2+、Na+、K+等金属离子对酶活有促进作用。关键词：木聚糖酶，根霉属,酶学性质中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：Screening of Xylanase strain and studies on its condition of producing enzymeXU Haiyan,LU Yanhua,ZHANG Zhiyun,LI Yongsheng,YANG Xianghua(College of Environment and Bioengineering, Liaoning Shihua University, Fushun 113001,China)ABSTRACT: separation, isolating and purification some stems of germ engendering xylanases through nearly 200 samples, we select the LXY-8 strain of highest xylanase activity. It was identified as Rhizopus. The studies on enzymacatic characterization indicate that the optimum conditions were: temperature is 30;initial pH of xylanase is 4.6，initial pH of cellulolytic enyme is 5.0；the remnant xylanase axtivity would be 80% when the pH vaule is 27; mental ion Co2+、Mg2+、Na+、K+ has simulative function to enzymic activity.Key words: xylanase, Rhizopus, enzymacatic characterization玉米秸杆和玉米芯中富含半纤维素，其主要成分是木聚糖，但多未有效利用。木聚糖酶能利用其中的半纤维素生产经济价值较高的产品，且其主要水解产物为低聚木糖，可增殖动物肠道内的双歧杆菌1，具有特殊的生理功能，木聚糖酶还可用于纸浆的预漂白，有效降低环境污染，其在饲料、食品、和造纸等行业中广泛的应用前景。1 实验器材1.1实验材料1.1.1 样品来源：土样、腐烂的玉米秸杆、玉米芯、牛胃瘤胃及牛粪等。1.1.2 主要实验仪器蒸汽高压灭菌器、VIS-7220型分光光度计、霉菌实验箱、LD510型离心分离机、无菌空气净化台、生化培养箱冰箱。1.1.3 培养基组成（1）马铃薯葡萄糖培养基（PDA）2：马铃薯 20g，葡萄糖2g，琼脂2g，水100ml。（2）固体初筛培养基：6g玉米秸秆，2的营养盐（g/L）（KH2PO43.0，CaCl20.5，MgSO47H2O0.5，NaNO33.0，FeSO47H2O7.510-3，MnSO4H2O2.510-3，ZnSO42.010-3，CoCl23.010-3，自然pH值），9.0ml水。（3）液体培养：马铃薯浸出液500mL，葡萄糖10g，121条件下灭菌30min。2 实验方法2.1菌株的鉴定方法32.2 菌种的发酵及粗酶液的制备将分离到的株菌分别接种到装有50mL液体培养基的三角瓶中，30振荡培养（转速为125r/min）培养6d，将培养液于4、4000 r/min离心分离15min，取上清液作为粗酶液。2.3 木聚糖酶活测定43 结果与讨论3.1菌种的分离筛选从近200分土样、腐烂的玉米芯、玉米秸秆及牛胃、牛粪5中分离纯化出LXY-1、LXY-2、LXY-3、LXY-30，这30种菌在固体初筛培养基中都产生明显的半纤维素水解圈，说明对玉米秸秆做底物的木聚糖具有明显的降解作用。测粗酶液中木聚糖酶活、纤维素酶活，从中选出酶活较高的5种菌株，结果见图1。图1木聚糖酶活和纤维素酶活力测定结果如图1，LXY-8菌株产木聚糖酶和纤维素酶活力最高，分别达到3158u/ml.min、1885 u/ml.min。所以选择该菌株进行培养，并对其酶学性质进行研究。3.2对LXY-8菌株产生酶性质的考察3.2.1发酵起始PH值对产酶的影响在不同pH值的0.2mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中LXY-8水解木聚糖的活力不同。图2 发酵起始pH值对木聚糖酶和纤维素酶活的活性的影响如图2，LXY-8菌株在较低的pH环境中有利于木聚糖酶及纤维素酶的合成。木聚糖酶活在固体培养基初始pH为4.6时最高，可达4782 U/g，纤维素酶活在初始pH为5.0时最高，可达1885U/g。3.2.2木聚糖酶酸碱稳定性的考察图3木聚糖酶的稳定性的考察如图3，LXY-8菌株产木聚糖酶在pH27范围内酸碱稳定性较好，残余酶活保持在80%以上。3.2.3氧气含量对该菌株产酶的影响表1 氧气含量对该菌株产酶的影响25250试管装固体料量（mg）35810酶的活力（U/g）3112.74062.11810.81511.9如表1，氧气含量较小时，产酶活力较弱。氧气含量过大，则生长条件改善，生长旺盛，很明显该菌是好氧菌，充足的氧气量对它的生长是十分必要的，但并非最适产酶条件。3.2.4发酵温度对产酶的影响温度对LXY-8菌株的生长和木聚糖酶的产生有着显著的影响。图4 发酵温度对产酶的影响如图4，LXY-8的最适固体发酵温度为30 ，此时木聚糖酶活最高为4789 U/g，纤维素酶活也较高为1883U/g。3.2.5金属离子对菌株产酶活力的影响加入的各金属离子，其对酶活的影响如下。表2 金属离子对LXY-3菌株产木聚糖酶活的影响试剂(0.02mol/L)相对活性(%)试剂(0.02mol/L)相对活性(%)对照(H2O)100HgCL228.9NaCL118.1BaCL22H2O89.2KCL112.6MgSO47 H2O137.4CaCL22H2O96AgNO335.8FeSO46 H2O86CuSO45H2O9.6ZnSO4FeCL36 H2O7578CoCL2NiCL2124.643.5如表2，以水作化合物时的产酶活力为标准，对比可以得出：Hg2+、Ag+、Cu2+、Ni2+对木聚糖酶的活性有抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最强，酶活损失近90%； Mg2+、Co2+、Na+、K+对木聚糖酶有促进作用，Mg2+和Co2+等的激活作用较大，可使酶活性提高37.4和24.6，其它离子如Ca2+对酶活的影响较小。4结论筛选得到30株菌株，其中的高产株菌LXY-8为黑色灰色菌落，特征与毛霉相似，菌丝也为白色、无隔多核的单细胞真菌，多呈絮状，经生理生化指标测定其符合黑根霉的定义，初步鉴定其为黑根霉。本试验考察了酶的性质最终确定其发酵的最佳温度为30，起始pH值木聚糖酶为4.6，纤维素酶为5.0 。酶在pH27范围内稳定性较好，残余酶活保持在80%以上。Mg2+、Co2+、Na+、K+等金属离子对酶活有促进作用。LXY-8菌株产生的木聚糖酶活力很高，同时其纤维素酶的活力也较高，使分离提取两种酶制备酶制剂和用作饲料添加剂成为可能。参考文献1 赵林果,余世袁.生物制备功能性木低聚糖.南京林业大学学报，2000,24(6):27302 杨翔华，洪新.产木聚糖酶菌株的筛选及其产酶特性J.辽宁石油化工大学学报，2004，24（4）：3235.3 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册M.北京：科学出版社，2001,7986.4 李彩霞，房桂干.木聚糖酶活测定方法. 纸和造纸，2001，11（1）：60615 Catta MA ,Zeltwanger RL. Appl Enviro Microbiol 1995,61:43964402