Na+H+ 转运蛋白NHX1基因及其耐盐机制的研究进展

液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白及其耐盐机制的研究进展摘要：液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白通过液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase建立的跨膜质子梯度为驱动力，将Na+运入液泡区隔化，从而使细胞质中的Na+保持在较低水平，也降低了细胞渗透势避免了水分胁迫。分析Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括N末端的跨膜区域和C末端的胞质区域，前者对氨氯吡嗪脒（amiloride）及其衍生物敏感，是负责转运的区域，由9-12个跨膜结构域组成，这段序列在其他植物 NHX以及哺乳动物NHE中均高度保守。后者大约由300个氨基酸组成，结构域内含有多个蛋白激酶用位点，能够与钙调素（calmodulin）结合，参与多种信号反应，是调节活性的区域。将NHX1基因导入其它植物诱导表达能显著提高植物耐盐性，也能互补酵母NHX1突变的表型，而AtNHX1基因在离子动态平衡方面，细胞内囊泡运输，蛋白质定位以及其它细胞过程中也发挥作用。关键词：液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白 耐盐性 调控机理在干旱、半干旱地区，土壤表面盐分积累造成土壤盐碱化，严重影响农作物产量。如何改善土壤理化因素，增加农作物产量，以及改善干旱、半干旱地区生态环境，就成为盐生植物研究的出发点。耐盐植物抵御盐害的途径主要有三种：一是植物细胞对离子的选择性吸收限制Na+的进入；二是将胞质中的Na+排出；三是胞内的Na+储存在液泡中即Na+的区隔化【1】。Na+的外排和区隔化是目前研究的热点，通过膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白实现，其中存在于液泡膜上的Na+/H+ 逆向转运蛋白就是将Na+储存在液泡内。利用液泡膜上的H+-ATPase和H+-PPiase建立的跨膜质子梯度为驱动力【2】,将Na+运入液泡区隔化，从而使细胞质中的Na+保持在较低水平，也降低了细胞渗透势避免了水分胁迫。随着分子生物学的研究深入，已经从模式生物拟南芥、水稻以及盐生植物盐地碱蓬、刺槐、经济作物小麦、玉米等中克隆出表达该蛋白的基因。本文旨在对NHX1基因结构、耐盐机制及目前研究进展等方面作一综述。 一 NHX基因结构特点1.1 NHX分类 植物胞内NHX家族能分为两类，分别用符号I和II表示。所有的NHX I类成员都定位于液泡膜上，并在胞内形成一个独立的转运子分支。相对而言，II类的成员存在于植物内膜囊泡上，同时也包括定位于动物和细菌中多种内体上的同源蛋白。在已知基因组全序列的拟南芥和水稻中，NHX基因家族的序列大小几乎相同。拟南芥有6个NHX基因（AtNHX），水稻有5个NHX基因（OsNHX）。它们的分配方式相似，AtNHX1-4和OsNHX1-4构成I类,AtNHX5-6和OsNHX5构成II类。拟南芥和水稻的I类组成员显示出56.0-87.5%的相似性，而II类成员的相似性为78.7%，但是与I类的相似性只有21%-23%【3】。Zorb 等【4】克隆了玉米(Zea mays L.)NHX家族的六个成员ZmNHX16，其中，ZmNHX1，2，6 属于一个亚家族，与拟南芥AtNHX1，2 同源性高，而ZmNHX3，4，5 属于另一个亚家族，与拟南芥AtNHX46 同源性高。这六个成员具有器官和盐处理特异性的表达模式。1.2分子特征：分析植物Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括N末端的跨膜区域和C末端的胞质区域。前者对氨氯吡嗪脒（amiloride）及其衍生物敏感，是负责转运的区域，由9-12个跨膜结构域组成。后者大约由300个氨基酸组成，结构域内含有多个蛋白激酶用位点，能够与钙调素（calmodulin）结合，参与多种信号反应，是调节活性的区域【5】。Yamaguchi 等【6】分析了 AtNHX1 的膜拓扑学结构，他们发现 AtNHX1 蛋白的整个结构不同于人的Na+-H+交换蛋白NHE1和任何已知的其他Na+/H+逆向转运蛋白。AtNHX1 由 9 个跨膜区域和 1 个亲水的C末端结构域组成，其中3个推测的疏水跨膜区TM3、TM5、TM6 看上去与膜相连，实际上并没有跨过液泡膜。他们的结果还表明，AtNHX1 的 N 末端朝向胞质，但几乎整个 C 末端都位于液泡腔中。与其蛋白家族的其他基因相比，AtNHX1 N 末端很保守，对于 Na+/H+逆向转运蛋白的活性非常重要。AtNHX1的TM3区具有一个推测的氨氯吡嗪脒结合序列(FFIYLLPPI)，这段序列在其他植物 NHX以及哺乳动物NHE中均高度保守，氨氯吡嗪脒与真核生物Na+/H+逆向转运蛋白结合后能抑制其转运活性。AtNHX1 的 TM5 和 TM6 与人 NHE 中高度保守的 TM6 和 TM7 相对应，TM6 和 TM7 对 NHE1的转运活性很重要，但 AtNHX1 的 TM5 和 TM6 区不跨膜，所以很难说它们对于 AtNHX1 的转运活性起重要作用。另外，AtNHX1 的 TM3 与 TM5、TM6 可能分别构成了胞质和液泡中结合离子的结构，它们的方向决定离子运动的方向。Rajagopal等 【7】 对珍珠栗PgNHX1与AtNHX1、OsNHX1做了比较，后者含有9个跨膜结构域，而PgNHX1为5个跨膜结构域包括一个钙素结合区域，调控PgNHX1的活性，TM3、TM4区与AtNHX1、OsNHX1的保守性较高。Yamaguchi等【8】进一步分析了位于液泡腔内C末端，AtCaM15(类似钙调素的蛋白) 位于C 末端，依赖于 Ca2+和 pH 值，调控 Na+/H+转运蛋白底物的选择性，以及液泡中的 pH 值调控Na+/H+转运蛋白与阳离子亲和性。AtNHX1基因C末端的缺失使Na+/H+选择比率增加一倍，证实C末端的调节功能。二 耐盐机制NHX1 基因在植物耐盐性的作用主要表现在以下三方面：一是利用液泡膜H+ - ATPase 和液泡膜H+ - PPiase 产生的跨膜质子梯度将胞质中的Na + 逆浓度梯度运入液泡中；二是Na+/H+逆向转运蛋白的C末端对其转运活性和离子选择性的调控；三是NHX1基因在NaCl存在下诱导表达，同时NaCl、KCl、ABA正调控AtNHX1的转录水平。2.1 液泡膜H+ - ATPase 和H+ - PPiase提供质子梯度 盐胁迫下Na+大量涌入胞质内，破坏了原有的跨膜电化学势梯度和植物细胞内离子平衡，同时大量的膜蛋白H+ - ATPase、H+ - PPiase、Na+/H+逆向转运蛋白被激活。在Na+/H+逆向转运蛋白的调节下，H+ - ATPase和H+ - PPiase提供能量,产生跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡内。这样降低了胞质内的Na+含量，维持胞质正常的K+ /Na+比值,而且可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂,降低Na+对植物细胞的毒害作用【9】。即使在胞质内Na+浓度很低的情况下，Na+ 也可主动泵进液泡中，Cl-则被动的由阴离子通道进入液泡平衡膜内外的电荷差别【10】。2.1 C末端的调节作用 植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的C末端比质膜Na+/H+逆向转运蛋白的 C 末端短得多，仅有 100 多个氨基酸。AtNHX1的N末端朝向胞质而整个C末端亲水区域都在液泡内，Yamaguchi等【6】的转运研究认为AtNHX1的C端调节转运蛋白阳离子的运输，C末端可能是糖基化或其它蛋白修饰的位点。利用酵母异源表达系统进行末端缺失实验中，N末端缺失17个氨基酸引起Na+/H+转运活性轻微降低和 K+/H+转运活性的少量增加。亲水性C末端的82个氨基酸缺失使Na+/H+转运活性大大增加，而这种缺失导致K+和H+的运输速率相对降低， Na+和 K+的运输比率也是未修饰的两倍。说明AtNHX1的C末端对Na+/H+逆向转运蛋白活性及底物选择性具有调控作用。另外，Yamaguchi等【8】异源表达酵母细胞的实验表明AtCaM15(类似钙调素的蛋白) 定位于液泡腔内的 AtNHX1 C 末端，依赖于 Ca2+和 pH 值，随pH值的升高降低与AtNHX1 的连接，同时改变转运体对Na+/H+的选择性。关于 C 末端的作用以及调控机制，还有待于人们更进一步的研究。2.3 坏境对NHX1基因的表达调控 盐生植物如Mesembryanthemum crystallinum 和 Suaeda salsa在盐胁迫下，可诱导Na+/H+逆向转运蛋白转录、翻译的发生及V-ATPase酶活的增强，而拟南芥盐胁迫下，V-ATPase的亚单位D没显示变化。香雪球Lobularia maritime经盐处理后，表现出Na+/H+逆向转运蛋白在根、叶中的诱导表达，伴随着LmNHXl转录水平的增加，H+-ATPase E亚基基因LmVHAE转录水平增高的现象【11】，这与拟南芥植物有所不同。在盐胁迫和ABA调控AtNHX1的表达实验【12】中，NaCl、KCl、ABA可以正调控AtNHX1 的转录水平。对转基因拟南芥AtNHX1启动子-GUS的分析结果启动子区包含推测的 ABA反应元件(ABRE)，位于起始密码的 736-728 之间，ABRE元件存在于不同物种对ABA应答的基因中。由于 AtNHX1 启动子的活性可被 NaCl、 KCl和ABA上调, 表明AtNHX1的表达受盐和ABA的上调是在转录水平上的调控。NaCl 对 AtNHX1的上调程度在 abi1-1(ABA 不敏感突变体)、 aba2-1 和 aba3-1(ABA 缺乏突变体)中被减少，但在突变体 abi2-1、sos1(质膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 SOS1 突变体)、sos2(蛋白激酶基因SOS2突变体)和sos3(钙结合蛋白基因 SOS3 突变体)并无类似情况发生。ABA诱导的AtNHX1 的表达同样在 abi1-1 中被减少，但 abi2-1中没有。这些结果表明，盐胁迫下在转录水平上AtNHX1 表达的增强，部分地依赖于 ABA 的生物合成和 ABA 通过 ABI1 发出的信号。ABI1 可以调控NHX1 等基因的表达，ABI2 则可以通过抑制SOS2的激酶活性或SOS2底物的活性来负调控离子均衡。 三 目前研究进展 胞质内保持较高的K+/Na+比率是盐生植物抵御盐害的主要途径，在细胞质中维持高K+/Na+比率有二种方法：一 将Na+排出胞外；二Na+在液泡的区隔化。依靠Na+/H+转运蛋白建立质子电化学梯度将Na+储存在液泡中【13】。目前对Na+/H+转运蛋白NHX1基因的研究取得了较大进展。主要从以下几方面展开研究：3.1 NHX1基因表达可部分恢复酵母nhx1突变表型 Xia 等【14】利用RT-PCR从甜菜中克隆出与拟南芥NHX1同源的BvNHX1基因。将BvHNHX1在对盐敏感的酵母nhx1突变体ena1-4nhx1菌株中异源表达，结果证实BVNHX1至少与酵母NHX1基因功能部分等价。Hamada 等【15】从盐生植物滨藜中克隆出Na+/H+转运蛋白，命名AgNHX1。同时将其在酵母NHX1突变体中表达结果对NHX1的功能有部分互补性。而Gaxiola 等【16】将AtNHX1在对NaCl敏感的酵母nhx1突变体菌株中进行异源表达，结果表明AtNHX1 能抑制nhx1 突变体的敏感表型，AtNHX1 的某些功能和酵母NHX1 是等价的，AtNHX1 恢复酵母nhx1 突变体Na+耐性的功能与酵母内源的ScNHX1功能相似。3.2 过量表达AtNHX1基因增强植物耐盐性 在拟南芥植物中过量表达AtNHX1基因，转基因植株在200 mol NaCl的条件下生长发育良好。Apse 等认为耐盐性的提高与ANHX1的高水平转录，翻译及Na+/H+转运体活性有关【17】。Junsheng Zhao等将Atnhx1 转到tall fescue (Festuca arundinacea)中，过量表达atnhx1基因可以显著提高转基因植物耐盐性，200mM NaCl 溶液中，显出比对照组更强的耐性。在根细胞的液泡中积累了更多的Na+，归因于 Na+/H+逆向转运体活性的增强。他们认为Na+/H+转运体促进了Na+在根细胞的液泡中积累，减少了盐的毒害作用也就增强了植物耐盐性【18】。Xue 等【19】在小麦中过量表达AtNHX1，发现转基因小麦在盐土壤中谷粒产量提高，并且谷粒大而重。在100150mM NaCl 条件下，转基因植株与对照组相比，叶中积聚的Na+ 浓度较低，K+浓度较高。这些结果表明，提高液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白转录水平，能使小麦的耐盐性及在盐土壤中谷粒的产量提高。Gaxiola 等【20】的实验进一步证实耐盐性是由于液泡转运体的存在，他们将拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1及H+-PPase基因AVP1同时过量表达获得的转基因植株，结果比单独过量表达两者之一的转基因植株具有更强的耐高盐的能力。这些结果显示拟南芥液泡膜焦磷酸酶(H+ -PPase)AVP1的过量表达，明显增加了转基因植株跨液泡膜质子梯度，促进了AtNHX1 介导的活性，将Na+ 更多的区隔化至液泡。3.3 为了较深入研究NHX1基因的作用，国内外研究员做了很多的探讨。Sottosanto等通过T-DNA插入突变体NHx1植株和分析atnhx1缺失突变体DNA芯片，发现在对照及 100mM NaCl 盐胁迫的土壤条件下，探讨成熟植物缺失 AtNHX1 基因对其他转录本的影响，发现 nhx1 均影响了转录本的表达，而在100mM NaCl 胁迫下基因的变化更大；其次，在离子动态平衡方面，细胞内囊泡运输，蛋白质定位以及其它细胞过程中发挥作用【21】。Rajagopal 等【7】认为PgNHX1功能在整个生命周期都起作用，Na+大都积累在老叶中，种子中极少。自1976年分别首次在动物老鼠肾细胞质膜上和植物大麦质膜上发现Na+ /H+逆向转运蛋白。后发现的Na+ /H+逆向转运蛋白广泛存在于细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上。目前在NCBI上登录的Na+ /H+ 逆向转运蛋白核酸序列达到500多个。包括人类Na+ /H+转运体NHE1【22】、盐生植物中间偃麦草TiNHX1【23】、盐地碱蓬【24】、甜土植物甜菜BvNHX1【14】、经济作物小麦TaNHX1【25】、水稻OsNHX1【26】、刺槐RpNHX1【27】等动植物的Na+ /H+ 逆向转运蛋白。四、展望土壤盐碱化是人类面临的一个重要的环境问题，对农业的可持续发展构成了严重威胁。植物耐盐性是复杂性状，是多基因相互作用的结果，然而最近研究转单一基因能明显提高植物的耐盐性，其原因可能是Na+/H+逆向转运蛋白基因转化进入植物细胞后激活了一系列与耐盐相关的基因, 从而明显地提高了植物耐盐性。因此, 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白对植物的耐盐性具有重要的意义。我认为今后对液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的研究可从几方面展开：一在细胞和分子水平上探究其耐盐机理及调控的网络结构；二不断分离极端生境下野生植物的Na+H+逆向转运蛋白，研究此类蛋白在植物适应逆境中的特殊功能，发掘更强功能的基因；三将Na+H+逆向转运蛋白基因转入重要的农作物和牧草中，获得抗逆性强的优良转基因作物新品种，这对改良和利用大面积盐荒地，发展干旱、半干旱地区的农业尤为重要。参考文献【1】WU Wei-Hua. 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