高考生物一轮复习（基础知识整理+重难点聚集）专题5 DNA和蛋白质技术课件 新人教版选修1

一、一、DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定 1.实验材料的选择： 选用DNA含量相对较高较高的生物组织，如鸡血鸡血、菜花、洋葱等。2.提取原理：DNA与杂质的溶解度溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的耐受性耐受性不同。3.步骤：（1）破碎细胞：动物细胞（以鸡血为例），加入蒸馏水蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液滤液。植物细胞（以洋葱为例），加入洗涤剂和食盐洗涤剂和食盐 ，充分研磨和搅拌，过滤后收集研磨液。（2）去除杂质：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中 溶解度溶解度 不同，去除杂质。（3）DNA析出：在处理后的滤液中加入 等体积、冷却的酒等体积、冷却的酒精精 溶液，析出DNA。（4）DNA的鉴定：加入 二苯胺二苯胺 试剂，沸水浴，出现浅蓝色。二、PCR技术：全称是 多聚酶链式反应多聚酶链式反应。1.PCR原理：利用了DNA的热变性热变性原理，通过控制温度温度来控制双链的解聚与结合。2.PCR反应的条件：缓冲液缓冲液； DNA模板； 两种引两种引物物； 四种脱氧核苷酸；Taq DNA聚合酶聚合酶。 3.PCR的反应过程 （1）变性：温度上升到90以上，双链DNA在热作用下，氢键氢键断裂，形成两条单链两条单链DNA。 （2）复性：温度下降到50左右，两种引物通过碱基互补碱基互补配对配对原则与两条单链DNA结合。 （3）延伸：温度上升到 72 左右，在 TaqDNA聚合聚合 酶的作用下，以 四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸 为原料，根据碱基互补配对原则，合成DNA新链。 4.PCR扩增的方向：合成DNA方向是从子链的5端向3端延伸。 5. DNA含量的测定 （1）原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量含量有关。 （2）过程：稀释稀释对照调零测定测定计算。 三、血红蛋白的提取和分离三、血红蛋白的提取和分离1.凝胶色谱法和电泳的原理(1)凝胶色谱法：不同相对分子质量的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢较慢；相对分子量较大相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外移动，路程较短较短，移动速度较较快快。(2)电泳：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异带电性质的差异 以及分子本身的 大小大小 、形状、形状 不同使带电分子产生不同的 迁迁移速度移速度 。2.凝胶色谱法分离蛋白质的实验操作步骤 （1）样品处理：红细胞的 洗涤洗涤 血红蛋白血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液 透析透析 。 （2） 凝胶色谱操作： 凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填样品的加入和洗脱 SDS聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳 。DNA的粗提取与鉴定1.基本原理：（1）DNA在NaCl溶液中的溶解度随氯化钠溶液浓度的变化而改变，DNA在0.14 molL的NaCl溶液中溶解度最低。（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。（3）DNA不被蛋白酶所水解。2.方法目的：3.两次加入蒸馏水的目的 第一次目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA；第二次目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。预冷的酒精溶液具有以下几个优点：a.抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解； b.降低分子运动，易于形成沉淀析出； c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。PCR技术1.PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合。2.DNA的合成方向DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。3.PCR的反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。4.细胞内DNA复制和PCR比较5.PCR技术优点及应用 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。 6.扩增DNA含量的测定方法（1）稀释：2L PCR反应液加入98L蒸馏水，将样品进行50倍稀释。（2）对照调零：以蒸馏水作对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3）测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。（4）计算：DNA含量（g/mL）=50（260nm的读数）稀释倍数 a.理论上DNA扩增呈指数增长，即一条DNA片段循环n次后数目为2n。b.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。c.通过控制温度来控制双链的解聚和结合，现在的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。 血红蛋白的提取和分离1.凝胶色谱法凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量较小的分子后流出。2.电泳电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、蛋白质、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。3.如何测定蛋白质的分子量 使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。DNA在氯化钠溶液中溶解度有二重性，随着氯化钠溶液浓度的变化而变化。（1）请在下列氯化钠溶液中选出能使DNA析出最彻底的一种 和溶解度最高的一种 。 A.0.14 mol/LB.2 mol/LC.0.15 mol/LD.0.3 mol/L（2）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以，可以推测溶于酒精中的物质可能有。（3）利用DNA与变蓝色的特性，将该物质作为鉴定的试剂。其实验过程要点是向放有的试管中加入4mL的。混合均匀后，将试管置于5 min，待试管，观察试管中溶液颜色的变化，这个实验也说明DNA耐温。DNA分子能溶于NaCl溶液，在较高浓度和较低浓度时都可以溶解，而在0.14 mol/L浓度下，溶解度最低，故可在该浓度时使DNA分子析出而得以粗提取。DNA分子不溶于冷酒精，利用该特性，可以去除其中的杂质，以进一步纯化DNA。DNA溶液中加入二苯胺，在水浴加热时，会出现蓝色的颜色反应，所以可用该方法鉴定DNA分子。 （1）AB（2）除去杂质某些脂类、蛋白质、糖类或其他大分子物质 （3）二苯胺DNADNA二苯胺试剂沸水中水浴加热冷却后高