westernblot的原理、操作及注意事项

v1.0可编辑可修改Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针， 对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定 的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng （最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的选择和制备 A:样品的制备 1组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入 3倍体积预冷的PB 0 c研磨，加入5XSTOPbufer , 180VV 6mins, 0c超声波破碎，5000rpm, 5mins离心，取上清。加入3 -ME加入，澳酚蓝 （加入）煮沸10min,分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。2细胞：细胞的处理方法： 离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集, 180VV 6mins, 0c超声波破碎，5000rpm, 5mins离心，取上清。加入3 -ME加入，澳酚蓝 （加入）煮沸10min,分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入3 -ME、澳酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩月尿法：双缩月尿法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫钱不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩月尿法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合， 形成紫蓝色络合物， 此物在540nm波长处有最 大吸收。双缩月尿法常用于 L10g/L含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性 质缓冲液，如 Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH解沉淀的蛋白质进行定量测定。 法：此法是双缩月尿法的进一步发展。他的第一步就是双缩月尿反应，即Cu+与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷铝磷-磷鸨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。此法比双缩月尿法灵敏得多，适合于测定20mg/L400mg/L含量的蛋白质溶液。 其干扰物质与双缩月尿法相同，而且受他们的影响更大， 硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在 pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷铝酸-磷鸨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法：大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干 扰物质的存在，在 280nm处的吸收可用于测定 ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质 常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。 有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当 校正，一般按下述公式粗略计算：蛋白戊法度（门中/mD - 1.55A“ - 0. 111280l cm A QuMlA之跳，是蛋白质溶液在280nm波长处（光程1厘米）测得的光密度值。是蛋白质溶液在260nm小波长处（光程1厘米）处所测得的光密度值。此方程是从烯醇酶（在酵母核酸存在时）得出来的。因此，对其他蛋白质和其他核酸不一定适用。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量不同，因此，浓度为%勺各种蛋0 1%白质在280nm处的消光系数（）在之间变化。所有的蛋白质在 230nm以下都有强吸收。例如，牛血清白蛋白的a % 225nm和215nm处分别为和，而在 280nm处测为。在230nm以下的强吸收是由于肽键的存在，因此， 此值对所有的蛋白质都是一样的。从215nm和225nm处的光密度之差可用于测定浓度为101/ml100d l/ml的蛋白质。蛋白质浓度可以近似地由下式得到：一务白质浓度;mg j - 144（、二 一 一 二）- i f-g 光密度之差求得，这一公式是减去溶液中非蛋白质成分产生的误差。但是，蛋白质之间的分子量差异比较大，因此，在比较几种蛋白质含量时，必须作适当的校正。由于蛋白质的吸收峰常因 pH改变而变化，所以在制作标准曲线时，必须与样品条件一致。4 . Bradford 比色法：Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-疏基乙醇、乙酸、硫酸俊、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。分别在两组微量离心管中各加入ml牛血清白蛋白（5, 10, 15和20）,以l NaCl补足至1006，同时以两管100 口 的l NaCl作空白对照。每管各加入 1ml考马斯亮蓝染 料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量比色杯测 A595,取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100 pg的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在 10-100科g另作一标准曲线进行测定。5 .电泳估算法（我们选择此法）：样品倍比稀释，SDS-PAG由泳，同时做定量 marker对照，可以估算样品大概浓度。 以提取癌组织总蛋白为例： 取等量胰腺癌组织、 癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O洗510次，再用预冷的1 X PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。 每2克组织加入3ml 1 X PBS匀浆，保持在4c条件进行。 加入5X STOPBuffer缓冲液1ml,混匀，4c下超声碎化。再加入 3-ME,澳酚蓝， 煮沸10mins,至此，制样过程完成；SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS- PAGEA:实际操作1 .做胶前的准备1）检查是否有足够的、干净的 spacer、comb和架子。2）检查是否有新鱼的，足量10%APS没有立刻重配。3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分 的用量。2 .制胶，电泳1）装好架子。2）按照下面配方配制分离胶。（单位：ml, Total : 8ml）%10%15%2 x Sep. buffer44430%4ddH 2O0TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在胶上面加入一层蒸储水，促进胶更好的凝集。3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。（单位：ml, Total3%2X Stacking. buffer30%ddH 2OTEMED5ul10%APS50ul倒好后插入预先准备好的梳子。4）待胶凝集好后，上样，电泳。上层月对i 60-80V电压，当样品至分离胶时，用 100-120V电压。一般电泳时间在小时左右。B :注意事项及常遇到的问题1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。2）上样蛋白量不应超过 30ug/mm2 （载荷面即：如果你的胶槽是5mm 1mm则载荷面为：2、1mm 5mm=5m）n。3 ） gel通常在内凝集最好，过快表示TEMED APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4 ）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。5）电泳中常出现的一些现象：条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。三、转移在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有 NC膜、DBM DDT尼龙膜、PVD得。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P （）和 Immobilon-PSQ for MW=膜 =胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须 随时保持湿润（干膜法除外）。4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下 滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。5）转移时间一般为 小时，（1mA-2mA/cm2, 10% gel）,可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。B湿法我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。C转移后效果的鉴定1 .染胶用考马斯亮兰染色经 destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。2 .染膜有两类染液选择，可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red、Fastgreen FC CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料， 如考马斯亮兰、india ink 、10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。四、封闭（block ）封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。常用的封闭液有 bovine serum albumin（BSA） , non-fat milk ,casein , gelatin ,tween-20 等，我们一般用 non-fat milk 。在转移结束前配好 5%勺Milk（TBST溶解）。转移结束后将膜放入milk中block（ 一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜），并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。Block 4 C O/N,或 RT 1 小时。五、孵育一抗A. 先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。B. 配好5%勺Milk（TBST溶解），按要求稀释好抗体。注意，如需高比例稀释， 最好采用梯度稀释。C. 将稀释好的抗体和膜一起孵育。一般采用RT 1小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间。注意：为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。六、洗涤用TBST先快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。然后5mins *5 。洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。七、孵育二抗孵育RT1小时。一般采用HRP示记的二抗，稀释比例为1:5000。二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择 HRP AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核 素等）的。八、洗涤用TBST先快速洗三次，把 milk尽快的wash掉。 然后5mins *5 。洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。九、显色（HRPB）1 .增强化学发光法（ECL）Ecl显色原理：氨基苯二酰肿类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺（luminol , 5/ -氨基-2, 3-二氢-1, 4-酗嗪二酮）的分子结构及化学反应 式如下：鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。试验步骤：1）将两种显色底物 1: 1等体积混合（一般各 1ml/membrane）。2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。4）在暗室中将 X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光 1min。5）显影、定影。6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。显色DAB （3,3二氨基联苯胺）和 HR瓶应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒 精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。对于AP标记的二抗我们选用 BCIP and NBT显色，它们在碱性磷酸酶（ AP）作用下反 应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。十、分析结果及其判断常见问题原因分析及处理方法：见附录一、二。附录一：Troubleshooting Blotting Problems( P43 48)附录二： Western Blotting Troubleshooting Logic Tree( P390 394)附录三：试验中所用到的试剂和缓冲溶液1) 5x Stop Solution (Sample buffer):Stock:to use:20% Glycerol100mltake stock10% SDS 50g or 250ml 20% SDS add BME250mM Trisbromphenol blue ortotalpyronine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix):bis-acrylamide% acrylamidetotal100ml3) 2x Laemmli Separation Buffer:Tris-HCl% SDS 10ml 20% SDStotal1000ml4) 2x Laemmli Stacking Buffer:Tris% SDS 1gtotal500ml5) 10x Laemmli Running Buffer:250mM TrisGlycine1% SDS 20gtotal2 liters6) Transfer Buffer:48mM Tris base39mM Glycine% SDS20% MeOH 200mltotal1000ml7) TBST:10mM Tris-HCl ,100mMNaCl%Tween-20Total1000ml8) Coomassie Stain :40%MeOH 400ml10%HAc 100ml%BBR 1g Brilliant Blue Rtotal1000ml9) Destain:30%MeOH 300ml%HAc75mltotal1000ml10) 10 x丽春红染液配方：丽春红2g磺基水杨酸30g三氯醋酸30gtotal100ml11) DABDAB50mgL TB () 100ml30%H 2Q 30-40ul先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20 C避光保存，H2Q在工作液中终浓度%。13