01第一章生物化学技术原理及应用

第一编第一编 概概 述述生物化学技术原理及应用主讲：孙伟第一章第一章 生命大分子物质的制备生命大分子物质的制备w 第一节第一节 材料的选择与处理材料的选择与处理w 第二节第二节 确立测定方法确立测定方法w 第三节第三节 细胞的破碎细胞的破碎w 第四节第四节 抽抽 提提w 第五节第五节 浓浓 缩缩w 第六节第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价w 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析w 第八节第八节 应用实例应用实例w 生命大分子物质通常是指：生命大分子物质通常是指： 动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的等有机化合物的总称。等有机化合物的总称。 生命科学研究将进入。分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。 本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定(这部分移至后面的章节介绍)等步骤。 第一节第一节 材料的选择与处理材料的选择与处理 一、材料的选择一、材料的选择 A. 是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其他物质则统称。 B.B.有效成分在材料中存在的特点有效成分在材料中存在的特点u有效成分的含量一般较少有效成分的含量一般较少 如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。u有效成分稳定性较差有效成分稳定性较差 大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。 选用的材料材料不同，有效成分的含量含量就不同； 选用的材料即使相同，但是部位部位或生长期生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。 C.C.材料选择应遵循的原则材料选择应遵循的原则w 有效成分含量多、稳定性好w 来源丰富、保持新鲜w 提取工艺简单w 有综合利用价值等 二、材料的处理二、材料的处理 选择到合适的材料后，应，或采用或等方法处理。 同时还应将易于去掉的非需物质除去。 1 动物脏器动物脏器 (1)冰冻冰冻 应在很短时间内置-10冰库(可短期保存)或-70低温冰箱(数月不变质)贮存。 脱脂脱脂 脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。 一般脱脂的方法有： A.人工剥去脏器外的脂肪组织； B.浸泡在脂溶性的有机溶剂(如丙酮、乙醚)中脱脂； C.采用快速加热(50左右)、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去； D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。 (2)干燥干燥 A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用； B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。 2 植物组织植物组织 A.叶片叶片 用水洗净即可使用； 或在l0h内置-4-30冰箱贮藏备用。 B.植物种子植物种子 需泡胀或粉碎才可使用。 材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。 3 微生物微生物 为制备生命大分子物质的主要材料之一。 用离心法收集到的上清液， 可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分； 可置低温下短时间贮存。 收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分； 或制成冻干粉，在4保存(数月不会变质)。第二节第二节 确立测定方法确立测定方法 一、目的与要求一、目的与要求 测定哪些材料含有目标有效成分？ 哪些材料含量丰富？ 提纯过程纯度是否逐渐增加？ 要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。 因为：有效成分在原材料中含量较低；底物要专一性的。二、常用的测定方法二、常用的测定方法 1.1.光谱法光谱法2.2.电化学法电化学法3.3.生物活性检测法生物活性检测法4.4.免疫分析法免疫分析法5.5.生物传感器生物传感器 1 光谱法光谱法(1)(1)吸收光谱法吸收光谱法 直接测定法；直接测定法；比色法比色法 (2)(2)荧光法荧光法(3)(3)浊度法浊度法 特点： 测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值； 且操作简单，反应迅速、灵敏； 结果也较准确， (1)吸收光谱法吸收光谱法 直接测定法、比色法直接测定法、比色法 直接测定法直接测定法 将待测物(如核酸、蛋白质)配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中， 即可从测定的消光值换算换算出待测物的含量含量。 A.A.测定核酸含量测定核酸含量 构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。 在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低，二者之间成正比关系。 通常1个A260值分别相当于 双链DNA 50gml 单链DNA 37gml 单链RNA 40gml 用A260A280比值可确定DNA和RNA的纯度： 纯DNA比值为1.8 纯RNA的比值为2.0 当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。 B.测定蛋白质的含量及纯度测定蛋白质的含量及纯度 蛋白质(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。 比色法比色法 将待测物(如蛋白质、核酸、糖类)与相关试剂(见表1-2)或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。 例如： 邻苯二酚邻苯二酚( (在在275nm275nm有吸收峰有吸收峰) ) + + 邻苯二酚邻苯二酚-2,3-2,3-双加氧酶双加氧酶 黄色的黄色的- - 羟基粘康酸半醛羟基粘康酸半醛( (在在375nm375nm有吸收峰有吸收峰) ) 通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。 还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度 例如 纯细胞色素c还原型A550氧化型A280比值为1.25 1.28。 假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。 (2)(2)荧光法荧光法 特点： 荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。 当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光法却能求得满意结果。 如： NAD(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸)（辅酶） NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)（辅酶） 由于NADH2和NADPH2发荧光，用于偶联NADH2 (或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的还原反应系统进行荧光测定。 例子： 谷草转氨酶(GOT)活力测定 采用与苹果酸脱氢酶（MDH)相偶联反应进行。 天冬氨酸 +- 酮戊二酸 GOT 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 + NADH+H+ MDH L - 苹果酸+NAD+ 每生成1分子草酰乙酸分子草酰乙酸就消耗消耗1分子NADH，这样GOT活力就可通过测定NADH在340nm消光值的下降来求得。 (3)(3)浊度法浊度法 极稀的悬浮液悬浮液可采用此法测定，即测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。 例如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力测定方法之一就是采用此法(A420)。 培养液中细菌生长的浓度(A600) 也可用此法测定。 2 电化学法电化学法 有些反应过程会放出质子氢(H+)，可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的或。 例如：葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定该酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。 3 生物活性检测法生物活性检测法 大多数生命物质，尤其是一些物质，当把它们注射入动物的特定器官时，所属机体将发生相应的变化，并且二者间有一定的相关性。根据这一性质设计的方法，即可对生命活性物质进行检测。 如：在某个动物器官中注射某种激素，使器官细胞加速分裂，通过检测细胞的数量变化来推测激素的生物活性。 4 免疫分析法免疫分析法 采用之间发生的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，就可对有关物质进行灵敏的定性或(和)定量分析(详见第十九章)。 5 生物传感器生物传感器 用生物传感器中的具有分子识别功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗体、生物膜和微生物等作为敏感元件）与待测溶液中的某一进行反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量(详见第十七章)。 第三节第三节 细胞的破碎细胞的破碎 细胞是生物体的基本单位。 有效成分可以分泌于细胞外分泌于细胞外，也有存在于细胞内的。存在于细胞内的。 如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培养液中，用适当的溶剂可直接提取。 存在于细胞内的存在于细胞内的酶又有游离酶有游离酶和结合酶结合酶之分，前者游游离在细胞质中离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结合与细胞器紧密结合(如氧化还原酶和有机磷水解酶等)。 w 欲提取存在于细胞内的物质时，必须（个别的则例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。w 动物脏器的，极易破损，往往在组织绞碎或提取时就被破坏了。w 植物和微生物的，需要在提取前进行专门的破细胞操作。一、机械破碎一、机械破碎1 研磨法研磨法剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研碎。 用匀浆器匀浆器处理，也能把动物细胞破碎。 大规模生产时，可用电动研磨法电动研磨法。 细菌和组织的细胞破碎均可用此法。 2 组织捣碎器法组织捣碎器法这是一种剧烈的破碎细胞方法。捣碎器(8 00010000r/min)处理3045s，植物和动物细胞能完全破碎。 3 超声波法超声波法 它是借助的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 4 压榨法压榨法 此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 用1.771083.54108Pa的压力迫使几十毫升通过一个(20kDa)或甘油中。 10ml抽提液可在1h内浓缩到几乎无水的程度。 这种方法的浓缩速度与透析袋的表面积以及PEG的数量有密切关系。 B.真空透析 五、减压蒸馏法五、减压蒸馏法当真空度较高时溶液的沸点可控制在当真空度较高时溶液的沸点可控制在3030以下。以下。 这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。 六、冰冻干燥法 冰冻的抽提液在真空状态下，可以由。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不会破坏。 冻干机 冻干机主要由：低温干燥箱、真空泵和冷冻机构成。 第六节第六节 纯化方案的设计与评价纯化方案的设计与评价 纯化方案：纯化方案： 是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法(如沉淀法、离子交换层析、葡聚糖凝胶等)有机地互补联合、灵活应用的总称。 一、纯化方案的设计一、纯化方案的设计 依据抽提液中和之间理化性质的差异性，从诸多方法中挑选出两种、两种以上乃至更多种分离方法组成一个纯化方案。 各分离方法的排布： 一般地，选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法； 选用精确、费时和需样品量少的方法。 二、纯化方案的评价二、纯化方案的评价 对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价。 这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出。 方法：纯化过程的每一步收集到的溶液要进行：的含量测定； 并计算：(活力单位数毫克蛋白)(每步的比活力粗抽提液的比活力)(每步的总活力/粗抽提液总活力）100 视的大小，的高低，就能初步确定每种分离方法的。w 一般认为：凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的。反之，则应用价值不大，也不宜采用。 w 但是，在纯化过程中，随着纯化倍数的增大，有效成分的含量却是逐渐减少，收得率也往往100(除非抽提液中存在酶的抑制)。 w 因此，实践中对纯化倍数和收得率的要求是根据材料来源的难易而变化的。若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数(见沉淀法)。 例子 以从赛氏杆菌(Serratia sp)提取L-门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率的关系(见表1-7)。表表1-7 L-门冬酰胺酶的纯化门冬酰胺酶的纯化活力单位数毫克蛋白= 每步的比活力粗抽提液的比活力= 每步的总活力/粗抽提液总活力100步骤步骤 总蛋白总蛋白/g 总活力总活力/u 比活力（比活力（u/mg） 纯化倍数纯化倍数 收得率收得率/%1.粗抽提液粗抽提液 30 21000 0.7 1 100 2.氯化锰处理氯化锰处理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰冻融解冰冻融解 5.58 14872 2.7 3.8 714.DEAE-纤维纤维 0.113 5025 44.5 63.5 24 素层析素层析5.硫酸铵盐析硫酸铵盐析 0.048 3367 71.7 102.0 176.羟基磷灰石羟基磷灰石 0.016 3133 200.0 286.0 15 柱层析柱层析7.PAGE 0.012 3100 255.0 365.0 15此处，是用表示用表示 纯化的不同，表示其含量和相对纯度的单位亦不一样。 如纯化的物质是胰岛素，其将用表示，用单位表示。 第七节第七节 有效成分纯度和性质的分析有效成分纯度和性质的分析 在实践中 常用于鉴定生物制品的方法有：电泳(见第十八章)、免疫分析(见第十九章)、薄层层析和薄膜层析(见第三章)等。 用于检测其的方法有：光谱法和气相层析(见第二十章)等； 用于测定有效成分的方法有：凝胶过滤(见第六章)和电泳法等； 用于测定的方法有：化学直读法、酶解直读法(见第十三章)等； 用于测定的方法有：与Endman降解法相结合的薄膜层析等。 第八节第八节 应用实例应用实例 叶绿体的提取与叶绿体的提取与4.5S RNA的制备的制备 叶绿体提取缓冲液： 0.3molL甘露糖醇或0.3molL蔗糖 4mmolL EDTA-Na2 50mmolL Tris-HCl(pH80) 5mmolL巯基乙醇 0.05牛血清白蛋白 RNA提取缓冲液： 50mmolL TrisHCl(pH8.5) 50mmolL KCl 4Triton X-100 新鲜植物 置4存放12天 匀浆处理（盛4倍于植物体积的缓冲液的捣碎器中高速匀浆处理 ） 纱布过滤（匀浆液经纱布过滤） 离心 (200g，5min) 收集上清液 继续离心 (30 000g，10min) 弃上清液 在沉淀中含有完整的叶绿体物质叶绿体放入缓冲液中，搅拌l0min离心（得上清液）苯酚抽提（上清液3次）加入110体积的3molL乙酸钠和2.5倍的95乙醇，-20静置过夜，再离心得沉淀接着用95乙醇洗涤干燥后即为4.5S RNA粗制品。 小结小结 生命大分子物质的制备生命大分子物质的制备: :w 材料的选择与处理材料的选择与处理w 细胞的破碎细胞的破碎w 抽提抽提w 浓缩浓缩w 纯化纯化w 鉴定（鉴定（有效成分纯度和性质的分析）