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精选优质文档-倾情为你奉上冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子,以CD4为例)(1) 冰冻切片室温晾干15分钟;(2) 用组化油笔将待染组织圈好,置PBS中浸泡10分钟,以去除OCT;(3) 用含10正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时(此步可以不洗涤,把封闭液吸干即可);(4) 加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA),4孵育过夜;(5) PBS洗3次,每次10分钟;(6) 加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司),37孵育1小时;(7) PBS洗3次,每次15分钟;(8) 封片后,荧光显微镜观察结果并拍照;(9) 在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。注意事项:(1)整个实验过程中勿使表面干燥 (2)稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光附注1:如目的分子为胞内分子,各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2:所用液体(表面分子染色不用0.3%TrixtonX100):(1) pH7.4 0.01MPBS: 配 方 为:0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0. 1MPBS 配 方 为:Na2HPO4 23g+NaH2PO42H2O 5.9g+NaCl 17g 定 容 至2000ml, 高 压,pH7.2-7.4 (2)洗涤液:0.3%TrixtonX100pH7.4 0.01MPBS,分装15ml/支20保存 (3)封闭液:10NGS0.3% TrixtonX100pH7.4 0.01MPBS,分装1.2ml/支20保存 (4)抗体稀释液:1BSA0.3% TrixtonX100pH7.4 0.01MPBS,分装1ml/支20保存 一、操作方法及步骤:取材,未能固定的组织取材,不能太大太厚,厚者冰冻费时,大者难以切完整,最好为24×24×2mm。取出组织支承器,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上,冰冻。小组织的应先取一支承器,滴上包埋剂让其冷冻,形成一个小台后,再放上细小组织,滴上包埋剂。将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进退键,转动旋钮,将组织修平。调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在510um间。 二、冰冻切片时的注意事项:防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净,需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方,如果有残余的包埋剂粘于刀或板上,将会破坏甚至撕裂切片,便切片不能完整切出。多例多块组织同时需做冰冻切片时,可各自放于不同的支承器上,于冷冻台上冻起来,然后依据不同的编号,依序切片,这样做既不费时也不会乱。放置组织冰冻前,应视组织的形状及走势来放置,所谓“砍柴看柴势”,切片也是如此,如果胡乱放置,就不能收到很好的效果。组织块不须经各种固定液固定,尤其是含水的固定液,在未达到固定前,更不能使用(?不用固定吗?-weibin )。临床快速冰冻切片,不须要预先固定,一是为了争取时间,二是固定了的组织,反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片,就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前,其中的水份也可渗入到组织中去,当冰冻发生时,这些水份就存留于组织中,形成了冰晶。当切片时,如果发现冰冻过度时,可将冰冻的组织连同支承器取出来,在室温停留片刻,再行切片,或者用口中哈气,或者用大拇指按压组织块,以此来软化组织,再行切片。另者,调高冰冻点。用于附贴切片的载玻片,不能存放于冷冻处,于室温存放即可。因为当附贴切片时,从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时,由于两种物质间温度的差别,当它们碰撞在一起时,分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力,使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片,由于温度相同,没有发生上述的现象。三、冰冻切片的快速染色方法: 切片固定30秒1分钟。 水洗。 染苏木素35分钟。 分化。 于碱水中返蓝20秒。 伊红染色1020秒。 脱水,透明,中性树胶封固。冰冻组织12分钟,切片1分钟,固定1分钟,染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程,结果与石蜡切片不相上下。冰冻切片的方法还有很多种,如甲醇循环的半导体冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等,这些方法在目前来说已很少使用. 常规方法:(1)冰冻切片固定 1030 s(2)稍水洗 12 s(3)苏木精液染色(60) 3060 s(4)流水洗去苏木精液 510 s(5)1%盐酸乙醇 13 s(6)稍水洗 12 s(7)促蓝液返蓝 510 s(8)流水冲洗 1530 s(9)0.5%曙红液染色 3060 s(10)蒸馏水稍洗 12 s(11)80%乙醇 12 s(12)95%乙醇 12 s(13)无水乙醇 12 s(14)石炭酸二甲苯 23 s(15)二甲苯() 23 s(16)二甲苯() 23 s(17)中性树胶封固。专心-专注-专业
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