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漂染废水对泥鳅红细胞核异常的诱导【摘要】探究了漂染废水在不同体积分数和染毒时间对泥鳅红细胞核异常的影响.结果表明,3种不同体积分数的漂染废水均能诱发泥鳅红细胞核异常.从试验结论得出,泥鳅红细胞的微核和核异常测定法可作为监测水环境中致突变化合物的一个较为实用的指标。【关键词】泥鳅 红细胞 微核 核异常 漂染废水随着工农业生产的迅速发展,水体污染问题日趋严重,尤其近年来漂染工业的蓬勃发展,水环境日益恶化，已对水生动物及人类造成了极大的危害，污染物对水生动物及人类的影响已引起人们的极大关注。因此,对污染水体中具有诱变和致癌活性的化学性质的检测显得十分重要.目前,除用理化方法对水体进行监测外,还可用生物学方法,如遗传学毒理学方法来检测不同环境中污染物对遗传物质的损害及毒理效应,从不同角度评价它们对人类和生物造成的潜在危害,其中比较简便迅捷而且敏感准确的检验方法为微核测定法(Micronucleus test)，该方法已被广泛应用于评价各种理化因子的致癌、致突变效应及环境监测等。微核测定法是二十世纪七十年代初建立起来的细胞遗传学方法之一.由于微核与染色质的突变具有较为密切的联系，所以长期以来微核被许多科研工作者用来评价毒物、放射性物质以及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤的指标。Buckley用水体中残留的氯成功地诱发银大马哈鱼(Oncorhychus kisutch)红细胞微核的形成,这是最早报道的水体污染物诱发水生脊椎动物的微核试验.Hooftman等用化学诱变剂甲基磺酸乙酯诱发泥荫鱼(Umbrapygmaca)外周红细胞微核的形成1.近年,国内学者用蝌蚪2-4、黄鳝5、泥鳅1、6-11等作实验动物,检测具有诱变活性的污染物有污水、农药、除草剂等.但至今尚未见到漂染废水诱发鱼类微核的报道.本探究使用工业上的漂染废水,探讨其不同体积分数和染毒时间对泥鳅红细胞微核形成和核异常的影响,为保护水源,治理污染提供科学依据.1 材料与方法1.1材料1.1.1试验鱼试验鱼为泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),购自仙游中心市场,体长811.5cm,体重2.54.5g,实验前暂养在实验室经曝气的符合饮用水标准的自来水中,实验时挑选健康活泼和体表无损的个体进行染毒处理.整个实验期间的水温范围为1325。 1.1.2试剂诱变剂:漂染废水,采自仙游某漂染厂。实验用水:曝气后的仙游大济中学校区生活饮用水,符合国家饮用水标准。1.2方法1.2.1染毒 实验在5个5L饲养缸内进行,在预试试验(以泥鳅在饲养阶段不出现行为、外形等的明显异常为标准)的基础上,将废水配制成体积分数为10、20、40三个试验组,另设一不加废水的对照组.对照组和每一试验组均投放15尾泥鳅。1.2.2血涂片制备 对照组和不同体积分数的试验组分别于染毒后的6、12、24、48取3尾泥鳅,断尾取血,制备血涂片.涂片晾干后,甲醇固定1min,用磷酸缓冲液(pH值为6.4)稀释的Giemsa液(9:1)染色1525min,蒸馏水冲洗，晾干。1.2.3血涂片观察 血涂片置于油镜下观察,每试验组随机观察3张涂片，每张血涂片随机观察1000个以上红细胞,观察指标为微核和核质外凸、核内空泡、无丝分裂、核碎裂等各种类型的核异常,并统计其微核及核异常细胞率,结果均以千分率()表示。微核细胞率=带有微核的细胞数/观察的细胞总数1000核异常细胞数=核异常（微核除外）细胞数/观察的细胞总数1000总核异常细胞率=微核细胞率+核异常细胞率2 结果与讨论2.1急性毒性试验 泥鳅刚染毒时,在烧杯中急剧游动,四处乱窜,片刻后便趋于平静,伏于水底,胸鳍张开,鳃盖启动.以后时常有泥鳅游到水面,头伸出水外,意欲跳出,此现象在高浓度较为明显.泥鳅中毒后,严重者昏迷沉底死亡.2.2漂染废水诱发泥鳅红细胞微核和总核异常细胞率的观察结果 泥鳅正常红细胞多呈椭圆形,少数呈圆形,泥鳅红细胞因漂染废水诱发产生的微核位于胞质中，为完全与主核分开的圆形或椭圆形微核，边缘清晰光滑，大小在主核的1/3以下，微核的染色深度与主核一致或略浅于主核。泥鳅红细胞除形成微核以外，还出现各种核异常的情况，包括核质外凸、无丝分裂、核内空泡等。经不同体积分数漂染废水染毒后的泥鳅红细胞的微核细胞率和总核异常率在不同时间下测定的结果见表1.表1 漂染废水诱发泥鳅红细胞的微核率/总核异常细胞率（）Table1 The micronucleus frequencies / the total frequencies of nuclear anomaties in loach erythrocytes induced by bleached waste （）对照组1020402.85/3.89 2.90/3.29 2.97/3.97 2.96/4.154.84/6.03 5.21/6.33 5.38/7.00 6.69/9.675.03/8.07 5.56/8.67 8.32/12.06 10.56/16.078.08/10.67 8.85/11.28 13.24/15.33 13.11/15.02由表1可知，经漂染废水处理后，泥鳅红细胞的微核细胞率和总核异常率均比对照组有明显升高。试验组微核细胞率最大值高达13.24为对照组的4.65倍；最小值也有4.84，为对照组的1.67倍；对照组的微核率平均为2.89，高于楼允东等7的实验结果1.03，这可能是由于本地泥鳅受污染较严重的缘故.泥鳅红细胞总核异常细胞率本底为3.82，经漂染废水处理后，泥鳅红细胞总核异常率最大值高达15.33 ，为对照组的4.66倍，最小值为6.03，为对照组的1.57倍； 方差分析12、13表明(表2),经漂染废水处理后的泥鳅红细胞微核和总核异常细胞率差异极显著(0.01),可见漂染废水对泥鳅红细胞微核及核异常具有极大的诱变效应.表2 漂染废水诱导泥鳅红细胞总核异常的方差分析Table2 Variance analysis of the rate of total of nuclear anomalies in loach erythrocytes induced by bleached waste变异来源平方和自由度均方FF0.05F0.01体积分数204.91368.3027.23*3.866.99染毒时间44.59314.865.92*3.866.99误 差22.5892.51总 变 异272.0715分析表明12、13(表3),体积分数为40试验组总核异常率与对照组之间差异极显著(P0.01),体积分数为20试验组总核异常率与对照组之间差异极显著(P0.01),体积分数为10试验组总核异常率与对照组之间差异显著(P0.05);另外,对泥鳅红细胞总核异常细胞率的影响, 体积分数为40试验组总核异常率与体积分数为10试验组之间差异极显著(P0.01),体积分数为20试验组总核异常率与体积分数为10试验组之间差异极显著(P0.01),体积分数为40试验组总核异常率与体积分数为20试验组之间差异不显著;出现此情况的原因可能是诱变剂量过高会抑制或终止细胞的正常分裂活动.这与汤新慧3的试验结果类似.另外,泥鳅的个体差异可能也是影响以上观测结果的一个因素.表3 不同体积分数的漂染废水诱导泥鳅红细胞核异常的多重比较Table3 The multiple comparison for the effects of NA in loach erythrocytesinduced by the bleached waste at different concentrations01020409.26*5.82*1.86207.39*3.96*103.44*分析表明12、13 (表4),经漂染废水处理48h后的试验组与经漂染废水处理6h的试验组之间差异极显著(P0.01), 经漂染废水处理48h后的试验组与经漂染废水处理12h的试验组之间差异显著(P0.05).但是,经漂染废水处理48h后的试验组与经漂染废水处理24h的试验组之间差异不显著,这可能是由于随着时间的延长,细胞的正常分裂活动可能受到抑制或终止,这与谢志浩等1的报道一致.另外,经漂染废水处理24h后的试验组与经漂染废水处理6h的试验组之间差异不显著,经漂染废水处理24h后的试验组与经漂染废水处理12h的试验组之间差异不显著,经漂染废水处理12h后的试验组与经漂染废水处理6h的试验组之间差异不显著,这可能是由于染毒的时间间隔不够长所致.表4 不同时间(h)漂染废水诱导泥鳅红细胞核异常的多重比较Table 4 The multiple comparison for the effects of NA in loach erythrocytes induced by the bleach waste at different times(h)61224484.06*3.83*1.64242.432.19120.232.3漂染废水诱发泥鳅红细胞微核在本试验中,漂染废水对泥鳅的毒性影响非常显著.即使在安全浓度14下,微核细胞率和总核异常细胞率都有显著提高.在不同体积分数的漂染废水作用下,微核细胞率的变化具明显的时间和剂量效应,这一结果与楼允东等7的报道相一致.但与符英丽等2的试验结果不同.另外,泥鳅刚染毒6 h时,微核细胞率随体积分数的升高而升高.而随时间的推移,从染毒后48 h开始,微核细胞率在较小体积分数时与体积分数呈正相关;但在体积分数为40时,却随浓度的升高而下降.这说明微核细胞率与浓度的相关性有一定的范围,超过此范围,因剂量过高会抑制或终止细胞的正常分裂活动导致微核细胞率下降.这与谢志浩等1报道一致.因处理时间不够长,无法看出,在各个体积分数哪一个时间段为微核出现的高峰时期,在哪个体积分数的试验组能达到最大的诱导效应.因此,应延长染毒时间,方能得出比较全面的结果.2.4漂染废水诱发泥鳅红细胞核异常试验过程中,发现漂染废水除对泥鳅红细胞微核细胞率有一定影响外,还同时出现其他的核异常现象,如核质外凸、无丝分裂、核内空泡、核破碎等.试验表明,经漂染废水处理后,泥鳅红细胞的总核异常率均有显著提高.总核异常率在各个时间阶段,基本上随体积分数的升高而提高,剂量过高,虽然抑制了细胞分裂使微核率下降,但其对细胞的损伤并没有减轻.如当试验组在体积分数较大的时候,出现了双微核和三微核的红细胞.2.5微核形成的机理的探讨微核是真核类生物细胞中的一种异常结构,呈圆形或椭圆形,游离于主核之外,大小应在主核1/3以下,其嗜染性与细胞核相似.有关微核的形成的原因,不同的学者2、6、9、10、15虽有不同的表述,但是基本上意见是一致的,即微核主要是由于染色体断裂产生的无着丝粒片段或分裂后期没有迁移到纺锤体极位上去的正条染色体滞留在胞质中形成,较大的微核很可能是在细胞分裂进入后期,由单一或一组落后的染色体形成,当主核向外突出时,就形成核质外凸,影响严重的就成为核碎裂,这表现在一些体积分数较高组中发现具有两个或三个微核的红细胞,这反映了遗传物质损伤程度的加重.引起微核产生的因素主要有四方面（吴昱等162020）：一是化学毒性物质,如秋水仙素等能直接抑制动物细胞的纺锤丝的形成,阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞两端；苯三酚在氧化成醌时产生活性氧损伤DNA和其他一些细胞大分子,不仅引起染色体结构和数目的变化,而且还可以通过产生新生氧间接引发点突变.二是放射线照射（放射导致遗传物质损伤诱发微核形成）；三是细胞成分缺乏（如叶酸）；四是其他致变因素如细胞凋亡（当程序性死亡基因激活后切割DNA形成细胞核碎片）；另外,在漂染废水对细胞有丝分裂的影响下,细胞核出现了中央缢裂,形成哑铃状的无丝分裂.其它许多细胞核则出现区别于一般正常细胞核形态的变形,变得很不规则.2.6泥鳅红细胞因漂染废水诱发出现的核变异中,主要包括微核和核异常3种不同体积分数的试验组诱发泥鳅红细胞的微核和核异常与处理体积分数存在着某种相关性.与楼允东等6的试验结果相同,这和谢志浩等10的观点不一致,其在泥鳅试验中发现微核率不表现出剂量-效应关系.在实验中,微核出现的比率比核异常要大,即微核的数量多于核异常数量.这与谢志浩等1的试验结果不同.3 小结从本探究的结果来看,漂染废水是一种较强的诱变剂,对泥鳅红细胞微核形成和核异常具有一定的诱变作用,经漂染废水处理后,泥鳅红细胞的总核异常率有显著的提高.3种体积分数的漂染废水所诱发的总核率与对照组差异极显著(P0.01),但由于处理时间不够长,无法得到较全面的结果.泥鳅对于核异常的诱发具有较高的的敏感性,且泥鳅分布范围广,在实验室内易饲养,且血量也较蝌蚪多,并能在不同季节评测水质状况.因此,可利用它作为水体监测和环境评价的鉴别材料.参考文献1谢志浩、王亚军除草剂杀草丹对泥鳅红细胞微核及核异常的诱导J宁波大学学报(理工版),1999.12(4):33-372符英丽、曾雪爱化学农药对蝌蚪染色体微核形成的影响J海南师范学院学报(自然科学版),2002.15(1):89-923汤新慧除草剂诱发蟾蜍蝌蚪红细胞微核的研究J中国环境科学,1998.18(2):162-1654耿德贵、张大生四种除草剂对中华大蟾蜍蝌蚪红细胞微核及核异常的影响J动物学杂志,2000.35(l) :12-165薛良义三种农药对黄鳝红细胞微核的诱导J浙江水产学院学报,1993.12(3):174-1796楼允东、吴萍两种农药对泥鳅红细胞微核和核异常的诱导J上海水产大学学报,1994.3(3):104-1107楼允东、吴萍亚硝基胍对泥鳅红细胞及核异常的诱发J中国环境科学,1996.16(4):275-2788向得标敌敌畏诱发泥鳅红细胞微核及核异常的观察J怀化师专学报,1997.16(5):61-639谢志浩、黄剑锋、陈国除草剂乙草胺对泥鳅血红细胞微核及核异常的诱导J科技通报,2020.19(1):77-8210谢志浩、蔡亚非、陈国等利用泥鳅红细胞微核及核异常测定法对四种除草剂遗传毒性的研究J现代农药,2002.(4):24-2711胡一中、邵晨、王世君除草剂克芜踪对泥鳅红细胞核异常的诱导J浙江师范大学学报(自然科学版),2020.26(2):180-18212李春喜、王志和、王文林生物统计学M北京:科学出版社,2000.95-9713杜荣骞生物统计学M北京:高等教育出版社,1997.126-12814尹伦甫几种药物对泥鳅的急性中毒试验J科学养鱼,2002.12.45-4615刘祖洞、江绍慧遗传学实验M北京:高等教育出版社,1985.261-262 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