包涵体蛋白质复性纯化

Yeast: 28%E. coli: 54%Animal cell: 21%E. coli inclusion body route occupies about a half 包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。包涵体的组成及特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果蛋白过量表达的结果。包涵体的形成 在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白蛋白质折叠的辅助因子质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。 包涵体形成的主要原因 1.表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体 3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素Advantages: 1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体 表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%3.包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心 就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性 前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。1. 对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。2. 要求复杂和精确的复性过程要求复杂和精确的复性过程3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的复性过程的收率往往很低，经常成为放大的 瓶颈瓶颈包涵体表达的不利因素Disadvantages: 分离纯化细菌包涵体蛋白质的分离纯化细菌包涵体蛋白质的： 破碎细胞破碎细胞 ( (Disruption of cell) ) 分离包涵体分离包涵体 (Seperation of inclusion body) 溶解包涵体溶解包涵体 (Dissolve inclusion body) 蛋白质产物的构象复原等。蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)包涵体的复性前准备洗涤洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解 1.采用高浓度的变性剂变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。2.去垢剂去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于（研究）。 3.极端极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。 4.还原剂还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM DTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂剂EDTA去除金属离子。去除金属离子。(伸展态)U(中间态)I(自然态)N A（包涵体） 从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。 蛋白质折叠的三态模型复性目的 复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。 蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键蛋白质的复性是重组蛋白纯化中最关键和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处和最复杂的问题。蛋白质的性质不同，所处的环境不同，使其复性条件大不相同。的环境不同，使其复性条件大不相同。任何任何一个蛋白质都有一个最佳的复性条件一个蛋白质都有一个最佳的复性条件，只有，只有选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正选择到了合适的复性缓冲液，使蛋白得以正确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利确折叠，才能使进一步的层析分离得以顺利完成。完成。 三、包含体蛋白复性方法三、包含体蛋白复性方法几个要求：几个要求：活性蛋白的回收率高活性蛋白的回收率高正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白正确的复性的产物易于与错误的折叠蛋白质分离。质分离。折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品复性过程耗时少复性过程耗时少复复性常用方性常用方法法 1.1.稀释复性稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。是体积增加较大，后续处理困难。 稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较稀释蛋白浓度：浓度高则容易形成聚集体（较低的复性收率）。有时需低于低的复性收率）。有时需低于0.01mg/mL0.01mg/mL。 脉冲流加复性脉冲流加复性：分批次加入到缓冲液中，使折叠：分批次加入到缓冲液中，使折叠中间体保持在较低的水平。例：在中间体保持在较低的水平。例：在5-10mg/mL5-10mg/mL终浓终浓度下，溶菌酶复性收率度下，溶菌酶复性收率可达可达80%80%以上以上。 2.2.透析复性透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作，无法应用到生产规模。适合大规模操作，无法应用到生产规模。 3. 3. 超滤复性超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上蛋白聚集于膜上）。）。4.4.色谱复性色谱复性：辅助手段，兼具分离。：辅助手段，兼具分离。 4.1 4.1 凝胶过滤复性凝胶过滤复性：除了蛋白质在胶粒中：除了蛋白质在胶粒中传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生传质和扩散外，蛋白质与介质之间并没有发生其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，其他作用。该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。对有些蛋白质的复性有利。 4.2 4.2 吸附型层析复性吸附型层析复性：离子交换、疏水层析、：离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本亲和层析和扩张床层析均属于吸附层析。其基本复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸复性原理是层析柱平衡后，将变性蛋白上样并吸附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附附在凝胶介质上，然后用清洗缓冲液洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的的变性剂和杂蛋白，最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱下来，在蛋白洗脱下来，在洗脱过程中完成复性。洗脱过程中完成复性。IB in E. coliIB(solid)IB(solid)Solubilized IBSolubilized IB(unfolded)(unfolded)AggregateAggregateRefolded Refolded Bioactive Bioactive monomer monomerRefoldingRefoldingSolution-stateSolution-stateSolid-stateSolid-state refoldingrefolding 5. 5.分子伴侣分子伴侣：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构：主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折酶、肽酰一辅氨酰顺反异构酶等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。性。 体内体内复性主要是在工程菌培养过程中同时加复性主要是在工程菌培养过程中同时加入分子伴侣的基因进行入分子伴侣的基因进行共表达共表达；体外复性主要是；体外复性主要是将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮将基因工程菌中包涵体溶解，再加入分子伴侣帮助折叠。助折叠。复复性性过过程中的添加程中的添加剂剂 低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。可防止不可逆聚集体的出现。性产率。可防止不可逆聚集体的出现。 盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是有效的促进剂。在非变性浓度下是有效的促进剂。S SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS SS S IBDissolved RefoldingE.g1:rhGM-CSF fr E.coli inclusion bodierhGM-CSF fr E.coli inclusion bodies sPhenyl Sepharose FFQ Sepharose FFSuperdex 75 Prep GradeHICIEXGFRenatured rhGM-CSFRemoves buffer constituents (Guanidine-HCl, Berol 185, glutathione etc)Purification factor: ca 2Recovery: 92% of activityConcentration factor: ca 5Belew, M. et al. (1994)J.Chromatogr. A, 679: 67-83大大肠肠杆菌杆菌包涵体表包涵体表达达 (His)6 融融合蛋白的合蛋白的扩扩增，增，纯纯化和化和复复性性E.g2:过程32细细胞培胞培养养收收获细获细胞胞细细胞破碎胞破碎离心离心5 - 10 000g沉淀物沉淀物冲洗和离心冲洗和离心分离包涵体分离包涵体HiTrap Chelating Ni2+ 纯纯化和化和复复性性溶解溶解包涵体 - 细胞破碎, 冲洗和分离n每每 100 100 ml ml 培培养养液重新液重新悬悬浮浮细细胞沉胞沉淀物於淀物於 4 4 ml 20 mM Tris -HCl pml 20 mM Tris -HCl pH 8.0 H 8.0 n在冰浴情在冰浴情况况下，用超下，用超声声震震荡荡破碎破碎细细胞，胞，并并在在+4+4C C下高速离心下高速离心 10 10 分分钟钟n重新重新悬悬浮浮细细胞沉淀物於胞沉淀物於 2 2 ml ml 含含 e.ge.g. urea . urea 的冲洗的冲洗缓缓冲液和再度超冲液和再度超声声震震荡荡n并并在在+4+4C C下高速离心下高速离心 10 10 分分钟钟n用冲洗用冲洗缓缓冲液冲洗冲液冲洗细细胞沉淀物胞沉淀物332 M UREA20 mM Tris HCl2% Triton X1000.5 M NaCl溶解和准备样品n重新重新悬悬浮浮细细胞沉淀物於胞沉淀物於 5 5 ml ml 溶溶解解缓缓冲液冲液 ( (e.g.):e.g.):20 mM Tris -HCl, 0.5 M NaCl,5 mM 咪唑, 6 M 盐酸胍,1 mM 2-巯巯基乙醇基乙醇pH 834在室在室温温等等 30-60 分分钟钟在在+4C 离心离心 15 分分钟钟用用 0.22 m 或或 0.45 m 濾膜濾膜过滤过滤准备 HiTrap Chelating 柱n冲洗冲洗 5 5 ml Hml H2 2O On加加 0.5 0.5 ml 0.5 M NiSOml 0.5 M NiSO4 4n冲洗冲洗 5 5 ml Hml H2 2O On用用 5-10 5-10 ml 20 mM Tris -HCl, ml 20 mM Tris -HCl, 5 mM 5 mM 咪唑咪唑, 6 , 6 M M 盐盐酸酸胍胍, ,1 1 mM 2-mM 2-巯巯基乙醇基乙醇pH 8pH 8 结结合合缓缓冲液洗柱冲液洗柱35最最多多 5 分分钟钟纯化和复性36稀稀释样释样品品, 用用 10 ml 结结合合缓缓冲液洗柱，冲液洗柱，5 mM 咪唑咪唑, 6 M 盐盐酸酸胍胍, pH 8.0上上样样，并并以以 20 mM咪唑咪唑, 6 M 尿素尿素 pH 8.0 缓缓冲液洗柱冲液洗柱 线线性梯度：性梯度： 6 to 0 M 尿素尿素 最少最少 30 柱体柱体积积 流速：流速： 0.1 ml/min - 1 ml/min 用用没没有尿素有尿素缓缓冲液冲洗冲液冲洗 5 个个柱体柱体积积线线性梯度性梯度: 20 mM - 500 mM 咪唑咪唑10 - 20柱体柱体积积用用 HiTrap Desalting 交交换缓换缓冲液去除冲液去除咪唑咪唑1.00.750.50.250102030 40506065mlManually using a syringe: Sample loading Gua-HCl wash Urea wash Startelutionfr. 38fr. 42fr. 46fr. 49fr. 40Start refold- ingA280组份分析371: LMW2: 样样品品3-6:盐盐酸酸胍胍冲洗物冲洗物7, 8: 尿素冲洗物尿素冲洗物1: LMW2-6:组份组份 38-427,8: 组份组份 48, 491.00.750.50.2505101520mlA280kD9467433020.114.412345678kD9467433020.114.412345678Superdex 75 HR 10/30SDS PAGE PhastGel Gradient 1015样样品稀品稀释释前前处处理理 : 用用 15% SDS, 30% 2-巯巯基乙醇基乙醇+10 mM Tris+1 mM EDTA稀稀释释1:5HiTrap Chelating 1 mlSuperdex 75 HR 10/30n文章信息信息 体内，蛋白折叠错误，引发疾病。如：帕金森、疯牛病等。 蛋白折叠理论也是蛋白质组学中的重要研究领域。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。AD的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为。