细胞实验课讲义

专业好文档实验一 实验前准备（4学时） 组织细胞培养技术要求无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一 目的及要求了解细胞培养实验室的设置和设备，掌握培养用品的清洗和消毒灭菌。二 细胞培养实验室的设置及设备1细胞培养实验室的设置 无菌操作区：无菌操作室，净化工作台，无菌操作箱 孵育区 制备区 储藏区 清洗和消毒灭菌区2细胞培养实验室的设备 仪器： 显微镜 培养箱 干燥箱 水纯化装置 冰箱 细胞冻存储存器 离心机及天平 消毒器 滤器 培养用器皿培养器皿：培养瓶 培养皿 多孔培养板培养操作有关的器皿：储液瓶 吸管 加样器 器械三 培养用品的清洗和消毒灭菌1 目的：去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。2 步骤 2.1 培养用品的清洗（1）清洗：实验后必须及时，彻底清洗，不同的器皿清洗方法和程序不同，应进行分别，分类处理。 玻璃器皿：用于培养细胞,细胞冻存，培养用液的存放等。A目的：玻璃表面清洗干净，无油迹，不残存任何毒性物质，而且带适当的电荷（苛性碱清洗剂使细胞表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。）B 步骤：a刷洗:毛刷和洗涤剂（不宜用力过猛），注意瓶角等部位的洗涤。洗刷后将洗涤剂冲洗干净，晾干。b 清洁液浸泡：清洁液（由浓硫酸 ，重铬酸钾及蒸馏水配置而成）浸泡过夜，或至少为6h以上。c 冲洗：流水彻底冲洗，每个器皿用流水灌满，倒掉，重复10次以上蒸馏水漂洗2-3次三蒸水漂洗一次烤箱烘干备用。 胶塞、盖子等步骤：（不能用清洁液浸泡）新胶塞先自来水冲洗，再进行常规清洗。用过的胶塞、盖子及时浸泡清水中，用洗涤剂刷洗。针头用洗涤剂洗涤干净1%稀盐酸浸泡30min，冲洗蒸馏水漂洗2-3次三蒸水漂洗1次晾干 包装：消毒前进行包装。 A目的：便于消毒及储存，防止落入灰尘即消毒后再次污染。B步骤：皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布等作为包装材料，对培养瓶、滤器、存放培养瓶用储液瓶、吸管、胶塞和盖子等物品的容器瓶口部分做局部包装密封，再用牛皮纸、玻璃纸或布包起来备用。培养皿、移液器吸头可以全封闭包装。注射器、金属器械可直接装入铝制饭盒等。2.2 培养用品的消毒灭菌 消毒灭菌的方法（物理方法和化学方法） 干热消毒：主要用于消毒玻璃器皿。一般在烤箱中进行，160，90-120min。 湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷气排出。消毒完毕后先打开阀门放气，再打开消毒器的盖。 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。 过滤消毒：用于组织细胞培养使用的液体。 消毒剂及抗菌素 用于操作人员皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面，实验室的椅、桌、地及空气的处理。主要有75%酒精、过氧乙酸等。 消毒方法的选择 实验室环境的消毒：紫外线消毒。实验室地面消毒：新洁尔灭溶液。 培养器械的消毒：多数采用干热或湿热消毒。 培养用液体的消毒：过滤。 净化工作台的消毒：紫外灯照射30-50min灭菌，用75酒精擦洗台面，关闭灭菌灯后应启动风机运转2min后再进行培养操作。实验二 光学显微镜的原理和应用（4学时） 在科研工作中，显微镜是必不可少的基本工具之一，特别是在细胞生物学、组织病理学等学科中发挥了极其重要的作用。本章重点介绍两种常用的显微镜：倒置相差显微镜、荧光显微镜一 目的要求1 掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。 2 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。二 倒置相差显微镜1 实验原理 波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中，可见光波的波长(及频率)的变化，表现为颜色的不同，振幅变化表现为明暗的不同，而相位变化肉眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时，虽然细胞内部结构厚度不同，但波长和振幅几乎没有改变，只是相位有了差别，所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。 相差显微镜(phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。倒置显微镜(inverted microscope)的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，它们之间主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此，可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，用来观察培养的活细胞。2 步骤(1) 首先将显微镜合轴。(2) 把视野光圈开大至与聚光器光阑边缘一致。(3) 将与物镜放大倍数一致的相板插入光路，选用与物镜放大倍数一致的相环插入聚光器中。(4) 把调中目镜换入目镜筒中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰。(5) 调节聚光器上的相环调中螺钮，使两个圆环图像重叠成同心圆状态。此时的相差装置就调节好了。换回目镜即可用于观察。3 注意事项(1)载物片或培养瓶必须平整、均匀；标本不能太厚，否则相差显微成像效果不好。(2)标本要在有水的环境中(如培养瓶中有培养液)，要用水封片等，成像效果才明显。(3)载物片、培养瓶的表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑，影响观察效果。(4)光路上最好加单色滤光片，如黄绿色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。4 用途 倒置相差显微镜主要用于观察正在培养的活细胞的生活特性，如细胞的生长、运动、发育、分裂、分化、衰老、死亡过程中细胞形态及其内部结构的连续变化。三 荧光显微镜 荧光显微镜(fluorescence microscope)是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。1 实验原理 某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等，经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。2 步骤 开启电源 打开电源开关，当电压表的指针稳定在220 V时再进行下一步操作。 启动高压汞灯：按启动键，汞灯即可燃亮。若尚未燃亮，可多按几次直至燃亮。等待10min左右汞灯达稳定状态后，再进行操作。 移开光帘(向右拉)，光线进入光路。 调中光轴 将灯前镜摆出光路。 用滤片组的2、3、4中任一组。放一张标本片在载物台上，选25物镜，调焦到成像。关小视场光圈，调凸镜调节杆到光圈在标本平面上面成像。调节聚光器调中钮至光圈图像居中。然后，恢复光圈到与视野等大。 调中光源 将灯前镜摆入光路。 拨动灯前镜调焦杆，使灯影光斑清晰。 先调节灯泡调中钮，到灯影光斑居中，再调节反射镜调中钮，到反射影光斑居中。最后将灯前镜摆出光路，即可正常使用。3 注意事项(1)观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。(2)载物片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质。(3)选用效果最好的滤片组。(4)荧光标本一般不能长久保存，若持续长时间照射(尤其是紫外线)易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。(5)启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的寿命。(6)若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，即可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。(7)较长时间观察荧光标本时，最好戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。4 荧光显微镜的用途 活体观察（观察活细胞内物质的吸收与运输，化学物质的分布与定位） 实验三 细胞传代培养（2学时）培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代：部分贴壁生长但贴附不牢固的细胞也可用直接吹打传代：悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。一 目的要求(1)了解细胞传代的一般方法和步骤。(2)进一步熟悉培养过程中的无菌操作技术。二 实验原理 当培养的细胞增殖达一定密度后，细胞的生长和分裂速度逐渐减慢、停止(出现密度抑制现象)，如不及时进行分离再培养(传代)，细胞将逐渐衰老死亡。将培养的细胞从一个容器以1：2或其他比率转移到别的容器中扩大培养，称为传代培养。三 实验用品1. 仪器与用品：普通显微镜、试管、吸管2. 试剂：DMEM细胞培养液，0.25%胰酶，PBS。 四 步骤 1洗细胞：取已长成或接近长成致密单层的细胞，倒去培养液，加入23ml PBS液，轻轻振荡漂洗细胞后倾去，以去除残留的血清和衰老脱落的细胞及其碎片。 2消化：加入适量(盖满细胞面即可)025胰蛋白酶溶液，室温下(或37)消化23min后，倒置相差显微镜下观察细胞单层，待细胞成片地收缩，出现许多空隙时即可倒去消化液(如消化程度不够时可延长时间)。再加PBS液轻轻洗一遍后倾出或直接进行下一步操作。如在酶消化过程中，见细胞大片脱落，表明消化过度，则不能倒去消化液(以免丢失细胞)，需加入等量的培养液吹打、收集细胞，800rmin离心5min后弃上清液后再进入下一步。 3接种：在培养瓶(离心管)中加入3ml培养液，以终止消化。用吸管反复吹打瓶壁上的细胞层，直至全部细胞被冲下，轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液，按1：2或1：3分配，接种到23个培养瓶内，再向各瓶补加培养液到5ml。也可以取细胞悬液计数，分别按需要的细胞密度接种到其他的培养瓶中，再补足培养液进行培养。 4观察：细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养液的颜色变化、细胞贴壁、生长情况等。若细胞贴壁存活则称为传了一代。五 注意事项 若只为了保留细胞，则吸取少量细胞悬液至另一瓶中，加入适量新培养液即可，不必经离心步骤。实验四 细胞冻存（2学时） 培养细胞的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费；而且细胞一旦离开活体开始体外培养，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外环境的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。一 目的要求1掌握细胞冻存的基本原则。2熟悉细胞冻存的基本过程。二 实验原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列变化，如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，导致细胞死亡。但如果在培养液中加入保护剂如甘油或二甲基亚砜 (DMSO)，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前析出细胞外，可使细胞免遭损伤。融解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的5O后，细胞仍能生长，活力不受损害。当前最常用的保护剂仍为二甲基亚砜(DMSO)溶液和甘油溶液，使用浓度范围在515之间，常用10的浓度。细胞悬液的冻结速度，多数细胞以每分钟下降1的速度降至一20，冻结均可获得满意效果。细胞采用液氮保存法，温度可达一40到一190，细胞可长期保存。三 实验用品1. 仪器与用品：普通显微镜、离心机、试管、吸管、冻存管2. 试剂：DMEM细胞培养液，0.25%胰酶，PBS, DMSO四 实验步骤1取生长旺盛的细胞(对数生长期)，倾弃培养液，加入适量经37预温的0.25胰蛋白酶溶液，消化分散细胞(时间同传代)。2弃消化液，加入24 ml含20血清的培养液，中止胰蛋白酶的消化作用。3吹打分散细胞，移入离心管中，平衡后1000rmin离心510min，弃上清液。4用同样的完全培养液制成含10 DMSO的冷冻保护液，放置冰浴中。5用冻存液重悬细胞，摇均匀。6将细胞悬液分别移到冷冻管中，每管11.5 ml(事先在管上标明细胞株名称、日期、浓度等)，旋紧管盖，放入纱布小袋中进行冻存。纱布袋一端系以线绳，末端扎有小牌，注明细胞名称、冻存日期、浓度等，以便查找。7进行冻存时一般以110 min的速度下降冻结为宜，可用程序控制冷冻仪控制。如果没有该设备，可采用以下方法进行冻存。将冷冻管先置于4冰箱2h，再移至-80低温冰箱1-24 h，然后立即投入液氮中(一196)，或短期冻存可直接在-80低温冰箱保存。五 注意事项 1 DMSO可高压灭菌(36kg，1 5min)。也可用无菌吸管在超净工作台内，从DMSO瓶中吸出(不要碰瓶口与瓶壁)，加入培养液中，由于微生物不会在DMSO中生长，只要无菌操作得当，不会发生污染。2 DMSO是有机溶剂，不可与橡胶接触。另外，使用时要避免与皮肤接触，因为它是一种很强的皮肤穿透剂。实验五 细胞计数及台盼蓝法测定细胞活力 （4课时）一、实验目的培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。二、实验原理当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。三、仪器、用品与试剂 3. 仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管4. 试剂：DMEM细胞培养液，0.25%胰酶，0.4%台盼兰， 5. 材料：细胞悬液6. 4台盼蓝母液配置：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4保存。使用时，用PBS稀释母液至0.4即可。四、实验步骤 （一）细胞计数1. 贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。2. 将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。3. 将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。4. 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞密度（四个大格细胞总数/4）104 个/ml （二）台盼蓝法测定细胞活力1. 贴壁生长的细胞，首先需将培养物制备成细胞悬液。2. 将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。3. 将细胞悬液以0.5 ml加入试管中。4. 加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液，染色23分钟。5. 吸取少许悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。6. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。压线细胞只计左侧和上方的。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。细胞密度（四个大格细胞总数/4)2104个/ml细胞活力 活细胞数/总细胞数100%血球计数板示意图五、注意事项1. 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；2. 显微镜下计数时，只数完整的细胞，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团10，说明细胞分散不充分，需重新制备细胞悬液，否则影响计数准确性。3. 如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。4. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。实验六 MTT比色法测定细胞相对数和相对活力（6学时）一、实验目的 活细胞计数法测定细胞数量和活力的方法不仅费时而且有一定的主观性。因此，在对细胞进行药物敏感性实验或是生物材料毒性作用等实验时，一般采取测定细胞相对数和相对活力的方法。MTT比色法就是其中最为常用的一种方法，其操作简便，灵敏度高，重复性好。二、实验原理噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。三、仪器、用品和试剂1. 仪器与用品：细胞培养箱、酶联免疫检测仪、普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、96孔板或其它孔板2. 试剂：DMEM细胞培养液、0.25%胰酶、受试因素（药物）、MTT（以PBS配制成5 mg/ml，抽虑除菌，保存在4C）、DMSO（二甲基亚砜）3. 材料：对数生长期细胞四、实验步骤（实用于贴壁细胞）1. 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，200 ul/孔，5000个/孔。2. 置37 、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。一般为412 h。3. 配置不同浓度的药物，在各孔中加入药物50ul，每组设定4复孔。时间依据实验需要，一般3天。4. 按照9：1的比例将DMEM培养液和MTT溶液（5 mg/ml）配置成混合液，使得MTT的终浓度为0.5 mg/ml。5. 小心吸去各孔内培养液，每孔加入150 ul上述混合液，继续培养14 h。6. 终止培养，小心吸去各孔内培养液。每孔加入150 ul二甲基亚砜，反复抽吸，使结晶物充分溶解。7. 在酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光值。8. 计算抑制率公式：（对照-本底）（给药-本底）/（对照本底）100%五、注意事项1. 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2. 每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3. MTT一般4C保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20C长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。4. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。实验七 冻存细胞的复苏（2学时）一、实验目的学习细胞复苏的方法，掌握长期保存体外培养细胞的技术。二、实验原理细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中或-80冰箱中的细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。三、仪器、用品和试剂1. 仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、离心机、试管、吸管、培养瓶2. 试剂：DMEM细胞培养液 3. 材料：冻存的细胞四、实验步骤1. 从液氮容器中或-80冰箱中取出冻存管，直接浸入37 温水中，并不时摇动约12min后冻存管内液体完全融化。2. 从37水浴中取出冻存管，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，拿入超净台内。打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍培养液，混匀；3. 离心， 1000 rpm，5 min；4. 弃去上清液，加入DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，以5105个/ml为宜。接种培养瓶，37 培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液，继续培养。五、注意事项1. 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-50，细胞仍能生长，活力受损不大。2. 将冻存管从液氮容器或冰箱中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3. 最好用新配制的培养液。实验八 细胞凋亡及荧光染色（4学时）凋亡是指细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。细胞凋亡机制复杂，一般采用多种方法综合加以判断。目前常用的方法有：形态学观察(光镜、电镜、荧光显微镜、倒置相差显微镜)、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞分析、凋亡细胞的原位末端标记(TUNEL)、细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)荧光显示等。荧光细胞化学是利用短波(紫外光等)能激发细胞内荧光物质并在荧光显微镜下呈现荧光影像的原理，对组织细胞的特定物质进行定性、定位、定量观察分析的一种技术。一、目的及要求（1）熟悉细胞凋亡的原理及检测方法。（2）熟悉荧光细胞化学的原理及荧光显微镜的原理的使用方法。（3）熟悉荧光染色法在细胞凋亡中的应用。（4）观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。二、实验原理细胞凋亡时产生最显著的变化是染色体固缩，DNA 裂解使细胞核形态发生变化。荧光染料Hoechst 33258 是一种无毒、水溶性双苯咪唑类化合物，可作为荧光探针与DNA 分子结合。在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst 33258 的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，Hoechst 33258 与之结合增强，染色呈强蓝色荧光，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染而正常细胞只呈微弱荧光，死细胞则不被染色，由此可检测出凋亡。三、实验用品 PBS或0.9%NaCl，Hoechst 33258，固定液，抗荧光淬灭封片液，盖玻片与载玻片，荧光显微镜。四、实验步骤1取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜。2刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4过夜）。3去除固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用手动晃动数次。4加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。5用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。6滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。7荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。五、观察结果 荧光显微镜下，可见凋亡细胞染色呈强蓝色荧光，细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，而正常细胞只呈微弱荧光。六、注意事项1染色时间严格控制，染色过久可导致假阳性。2荧光极易萃灭，故荧光染料和染色过程均需避光。实验九 细胞原代培养（8学时）一、实验目的 原代培养是从供体中取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步，也是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。二、实验原理初代培养又称原代培养（Primary culture ）即从供体组织获得组织首次所进行的培养，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，使细胞得以生存、生长和繁殖，一般1周后，进行传代培养。 细胞刚刚离开供体，其形态、功能状况很近似在体。都具有二倍体细胞遗传特性，代表在体状况。 三、仪器、用品和试剂1. 仪器与用品：普通显微镜、离心机、试管、吸管、培养瓶、平皿、手术器械2. 试剂：DMEM细胞培养液、PBS（含双抗） 3. 材料：新生大鼠四、实验步骤1. 将新生大鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡23秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内），取入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置于盛有PBS(含有200 U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。 2. 用PBS洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。3. 用眼科弯剪反复剪切将肝组织剪碎成1 mm3大小的小块，加入含有双抗的PBS，将肝组织块吹打开，静置片刻后，更换新的PBS。 4. 用吸管吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶2025块左右，每小块间距0.5 cm左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁24 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。注意上述操作过程中动作要轻柔，让液体慢慢覆盖组织小块，严禁动作过快致使液体产生的冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。48 h后换液，更换23 ml即可。 5. 贴块贴壁72 h后，镜下可见大量的细胞爬出，将组织块去除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。 五、注意事项1. 自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。新鲜组织细胞取出后，立即进行培养，4C 培养液内最多能保存 24h， 2. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。4. 耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，胰酶消化法：3用眼科弯剪反复剪切将肝组织剪碎成1 mm3大小的小块，加入含有双抗的PBS，将肝组织块吹打开，静置片刻后，更换新的PBS。4消化及分散组织块： 向上述清洗过的组织内加入5-6倍量的0.25%胰蛋白酶，置37消化。消化时间为20-40分钟，每隔10分钟摇动一次，以便组织块散开，一直消化至组织块变得疏松，黏稠状，并且颜色略变为白色为止。此时，在超净台中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培养液，用吸管反复吹打组织块，直到大部分组织块分散成混淆的细胞悬液为止。分散的细胞悬液可经两层灭菌的纱布过滤至另一烧杯中。5计数与稀释：取出部分过滤的细胞悬液，计数，后用培养液稀释。稀释后的浓度以30-50万/ml为宜。6分装与培养：将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，置37培养箱中。7观察：逐日检察培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞基本长成致密单层时，即可进行传代培养。实验十 细胞基因组DNA的提取 （4学时）了解基因组DNA提取的基本原理，掌握苯酚抽提法提取基因组DNA的技术要点一、实验目的练习使用苯酚抽提法提取中等长度片段的动物基因组DNA。二、实验原理为获取完整的基因组DNA，分离过程应尽量温和，以减少提取过程中对DNA大分子的机械剪切作用。常用的方案可采用蛋白酶K消化包埋的细胞核，在去除大部分细胞核蛋白成分后，可得到较大片段的DNA，长度可达Mb级，但该方案的成本较为昂贵，多用于染色体的分离、分析，以及大片段基因组文库的构建等。当DNA长度要求在kb级以下时，可采用酚抽提法去除蛋白质成分，在pH8.0的条件下，DNA基本分布于水相中，而变性的蛋白质位于上层水相与下层有机相之间的变性层。苯酚抽提法制备的DNA片段长度上限一般可达到50kb。三、仪器、用品和试剂4. 仪器与用品：高速离心机、匀浆器、冰浴箱、吸管、培养瓶、平皿、手术器械5. 材料：大白鼠6. 试剂：1） 抽提缓冲液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mol/L EDTA (pH 8.0), 20g/ml 胰RNA酶，0.5% SDS。2） Tris平衡酚 (pH 8.0)。3） 氯仿/异戊醇 （24：1）。4） 无水乙醇、90%乙醇、70%乙醇。5） TE溶液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol/L EDTA。四、实验步骤1 材料的获得：把大鼠拉颈椎致死，迅速取出肝脏，置于8-10倍体积的抽提缓冲液中匀浆，37温育1小时。2 苯酚抽提：随后加入与水相液体等体积的Tris平衡酚。反复颠倒离心管15-20分钟，以充分混合两相。5,000g离心15分钟，此时应见到上层的水相以及下层的有机相已经分开，位于两层之间的固相杂质为变性后的蛋白质成分等。3 回收水相：用大口径移液管吸取上层水相，小心转移到新的离心管中，由于溶液比较黏稠，注意不要搅动中间变性层和下层有机相。4 在新的离心管中重复酚抽提步骤1-2次，到变性层极少或几乎消失为止。5 最后一步抽提，加入一半水相体积的平衡酚，再加入一半水相体积的氯仿/异戊醇混合液。混匀，离心。这一步的目的是去除水相中残留的酚。6 沉淀：加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，可见白色的纤维状沉淀析出，用洁净玻璃棒轻轻搅动，使高相对分子质量的DNA缠绕在玻璃棒上。7 洗涤：把粘有DNA沉淀的玻璃棒以次在90%乙醇、70%乙醇中洗涤，以除去盐离子等杂质。8 沉淀风干，待乙醇挥发尽。注意不要过度干燥，否则很难溶解。9 沉淀溶于TE或水中。五、注意事项1苯酚对皮肤、眼睛有刺激性，实验中应小心，操作时戴手套，颠倒离心管以及打开离心管盖时，要防止苯酚溅到皮肤上。2也可先将平衡酚与氯仿/异戊醇等体积混合成酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液，再用于蛋白的变性抽提，其中氯仿可去除水相中残留的酚，并且具有稳定离心后形成的分离界面的作用，异戊醇则能抑制蛋白质变性过程中产生的泡沫。Winger Tuivasa-Sheck, who scored two tries in the Kiwis 20-18 semi-final win over England, has been passed fit after a lower-leg injury, while Slater has been named at full-back but is still recovering from a knee injury aggravated against USA.Both sides boast 100% records heading into the encounter but Australia have not conceded a try since Josh Charnleys effort in their first pool match against England on the opening day.Aussie winger Jarryd Hayne is the competitions top try scorer with nine, closely followed by Tuivasa-Sheck with eight.But it is recently named Rugby League International Federation player of the year Sonny Bill Williams who has attracted the most interest in the tournament so far.The Kiwi - with a tournament high 17 offloads - has the chance of becoming the first player to win the World Cup in both rugby league and rugby union after triumphing with the All Blacks in 2011.Id give every award back in a heartbeat just to get across the line this weekend, said Williams.The (lack of) air up there Watch mCayman Islands-based Webb, the head of Fifas anti-racism taskforce, is in London for the Football Associations 150th anniversary celebrations and will attend Citys Premier League match at Chelsea on Sunday.I am going to be at the match tomorrow and I have asked to meet Yaya Toure, he told BBC Sport.For me its about how he felt and I would like to speak to him first to find out what his experience was.Uefa hasopened disciplinary proceedings against CSKAfor the racist behaviour of their fans duringCitys 2-1 win.Michel Platini, president of European footballs governing body, has also ordered an immediate investigation into the referees actions.CSKA said they were surprised and disappointed by Toures complaint. In a statement the Russian side added: We found no racist insults from fans of CSKA. Baumgartner the disappointing news: Mission aborted.The supersonic descent could happen as early as Sunda.The weather plays an important role in this mission. Starting at the ground, conditions have to be very calm - winds less than 2 mph, with no precipitation or humidity and limited cloud cover. The balloon, with capsule attached, will move through the lower level of the atmosphere (the troposphere) where our day-to-day weather lives. It will climb higher than the tip of Mount Everest (5.5 miles/8.85 kilometers), drifting even higher than the cruising altitude of commercial airliners (5.6 miles/9.17 kilometers) and into the stratosphere. As he crosses the boundary layer (called the tropopause),e can expect a lot of turbulence.The balloon will slowly drift to the edge of space at 120,000 feet ( Then, I would assume, he will slowly step out onto something resembling an Olympic diving platform.They blew it in 2008 when they got caught cold in the final and they will not make the same mistake against the Kiwis in Manchester.Five years ago they cruised through to the final and so far history has repeated itself here - the last try they conceded was scored by Englands Josh Charnley in the opening game of the tournament.That could be classed as a weakness, a team under-cooked - but I have been impressed by the Kangaroos focus in their games since then.They have been concentrating on the sort of stuff that wins you tough, even contests - strong defence, especially on their own goal-line, completing sets and a good kick-chase. Theyve been great at all the unglamorous stuff that often goes unnoticed in the stands but not by your team-mates.It is as though their entire tournament has been preparation for the final.In Johnathan Thurston, Cooper Cronk, Cameron Smith and either Billy Slater or Greg Inglis at full-back they have a spine that is unmatched in rugby league. They have played in so many high-pressure games - a priceless asset going into Saturday.The Kiwis are a lot less experienced but winning a dramatic match like their semi-final against England will do wonders for their confidence.They defeated Australia in the Four Nations final in 2010 and the last World Cup, and know they can rise to the big occasion.