实验1 细菌的培养方法

2021/6/16 1 细 菌 的 培 养 方 法（ 综 合 性 实 验 ） 2021/6/16 2 1. 实 验 室 规 则2 录 相 ： 细 菌 标 本 的 采 集 和 细 菌 的 接 种 方 法3 操 作 ： 细 菌 的 接 种 法 （ 液 体 、 半 固 体 、 固 体 1套 /3人 ） 空 气 中 细 菌 的 检 查 （ 沉 降 法 血 平 板 1块 /6人 ） 呼 吸 道 细 菌 的 检 查 （ 咳 碟 培 养 血 平 板 1块 /3人 ） 随 身 物 品 的 细 菌 检 查 （ 普 通 平 板 1块 /3人 ）4. 材 料 ： 大 肠 杆 菌 斜 面 培 养 物 （ 1支 /6人 ） 碘 酒 、 75%酒 精 、 棉 签 等 （ 1套 /6人 ） 实 验 内 容 2021/6/16 3 教 学 目 标 了 解 ： 培 养 基 的 类 型 与 制 备 方 法 ； 细 菌 菌 落 的 观 察 常 用 的 细 菌 接 种 方 法 和 各 种 细 菌 的 培 养 方 法 掌 握 ： 1. 细 菌 的 液 体 、 半 固 体 、 固 体 接 种 2. 空 气 中 细 菌 的 检 查 方 法 沉 降 法 3. 呼 吸 道 细 菌 的 检 查 法 咳 碟 法 4. 随 身 物 品 的 细 菌 检 查 方 法 2021/6/16 4 实 验 室 规 则1. 穿 白 大 褂 ， 尽 量 少 带 物 件 进 实 验 室 。2. 严 格 按 老 师 及 教 材 要 求 进 行 实 验 ， 以 获 得 正 确 结 果 。3. 书 、 笔 记 本 、 笔 等 文 具 放 入 实 验 台 抽 屉 里 。4. 严 禁 在 实 验 室 喝 水 ， 吃 东 西 ， 用 嘴 咬 笔 或 标 签 ， 不要 用 手 抚 摸 头 、 脸 等 部 位 ， 以 免 发 生 感 染 。 微 生 物 学 实 验 的 对 象 多 为 病 原 微 生 物 ， 如 有 不 慎就 会 发 生 实 验 室 感 染 。 2021/6/16 5 5. 实 验 室 不 得 高 声 喧 哗 ， 保 持 安 静 ， 守 秩 序 ， 不 要 随 便 走动 ， 以 免 影 响 他 人 实 验 和 安 全 。6. 如 果 发 生 实 验 室 不 慎 ， 吸 入 菌 液 、 划 破 手 指 、 培 养 物 破损 传 染 物 外 溢 ， 应 及 时 报 告 ， 及 时 处 理 。7. 实 验 过 程 中 应 注 意 节 约 实 验 材 料 、 爱 护 仪 器 ， 损 坏 器 材要 及 时 报 告 、 登 记 、 并 作 相 应 的 赔 偿 。 实 验 室 内 物 品 ，未 经 老 师 许 可 ， 严 禁 带 出 室 外 。 2021/6/16 6 8. 每 次 实 验 之 后 ， 所 用 物 品 放 回 原 处 。 需 要 培 养 或 消 毒 处理 的 物 品 及 时 送 到 指 定 地 点 ， 用 过 的 涂 菌 载 玻 片 放 入 小桶 内 ， 不 得 乱 丢 乱 放 。9. 实 验 完 毕 ， 整 理 桌 面 ， 肥 皂 洗 手 ， 值 日 生 打 扫 实 验 室 卫生 ， 关 好 水 电 门 窗 ， 待 老 师 检 查 后 方 可 离 开 。 2021/6/16 7 细 菌 和 其 它 生 物 一 样 ， 大 多 数 属 异 养 菌 ， 必 须从 周 围 环 境 中 摄 取 营 养 ， 进 行 新 陈 代 谢 及 生 长 繁 殖等 生 命 活 动 。 人 为 地 提 供 细 菌 生 长 繁 殖 所 需 的 营 养 物 质 （ 适宜 的 培 养 基 ） 和 创 造 适 合 细 菌 生 长 繁 殖 的 有 利 条 件如 温 度 、 湿 度 、 气 体 等 ， 能 使 细 菌 在 体 外 迅 速 生 长繁 殖 。 细 菌 的 人 工 培 养 2021/6/16 8 细 菌 生 长 繁 殖 的 条 件 ：1 充 足 的 营 养 物 质2 适 宜 的 温 度3 合 适 的 酸 碱 度 （ pH）4 必 要 的 气 体 环 境 2021/6/16 9 一 、 细 菌 生 长 繁 殖 所 需 营 养 1 水 营 养 的 吸 收 与 代 谢 均 需 有 水 才 能 进 行 。2 碳 源 病 原 菌 主 要 从 糖 类 获 得 碳 及 能 量 。 4 无 机 盐 常 用 元 素 如 磷 、 硫 、 钾 、 钠 、 镁 、 钙 、 铁 等3 氮 源 其 主 要 功 能 是 作 为 菌 体 成 分 的 原 料 。5 生 长 因 子 某 些 细 菌 生 长 所 必 需 而 又 不 能 自 身 合 成 的 有机 化 合 物 。 2021/6/16 10 （ 一 ） 培 养 基 （ culture medium） 由 人 工 方 法 配 制 而 成 的 ， 专 供 微 生 物 生 长 繁 殖使 用 的 混 合 营 养 物 制 品 。 培 养 基 的 制 备 2021/6/16 11 （ 1） 按 用 途 划 分1） 基 础 培 养 基含 多 数 细 菌 生 长 所 需 要 的 最 基 本 营 养 ， 能 满 足 一般 细 菌 生 长 繁 殖 的 营 养 需 要 ， 如 肉 汤 （ 含 有 水 、牛 肉 膏 、 蛋 白 胨 、 氯 化 钠 等 原 料 ） 。2） 营 养 培 养 基在 基 础 培 养 基 中 加 入 葡 萄 糖 、 血 液 、 酵 母 浸 膏 等 。1、 培 养 基 的 类 型 及 应 用 2021/6/16 12 3） 鉴 别 培 养 基4） 选 择 培 养 基 在 培 养 基 中 加 入 一 定 底 物 和 指 示 剂 ， 而 不 同 种 类 的 细菌 由 于 分 解 代 谢 及 合 成 代 谢 能 力 的 不 同 ， 会 产 生 不 同 的 特征 性 培 养 结 果 ， 从 而 将 不 同 细 菌 区 分 开 来 的 培 养 基 。 在 培 养 基 中 加 入 某 些 特 殊 的 营 养 物 质 或 化 学 物 质 ， 使之 能 抑 制 一 些 细 菌 生 长 ， 而 有 利 于 另 一 些 细 菌 生 长 ， 从 而将 后 者 从 混 杂 的 细 菌 群 体 中 分 离 出 来 的 培 养 基 。 2021/6/16 13 SS琼 脂 培 养 基 大 肠 埃 希 菌 沙 门 菌志 贺 菌 2021/6/16 14 5） 厌 氧 培 养 基 用 于 培 养 厌 氧 性 细 菌 的 培 养 基 ， 此 时 需 要 在 培养 基 中 加 入 还 原 剂 降 低 培 养 基 的 氧 化 还 原 电 势 ， 厌氧 菌 才 能 生 长 发 育 。 u 疱 肉 培 养 基 不 饱 和 脂 肪 酸 和 谷 胱 甘 肽 2021/6/16 15 （ 2） 根 据 物 理 状 态 分 液 体 培 养 基 ： 增 菌 固 体 培 养 基 （ 琼 脂 浓 度 为 1.5 ） ： 分 离 培 养 半 固 体 培 养 基 （ 琼 脂 浓 度 为 0.5%） ： 动 力 检 查 液 体 培 养 基 固 体 培 养 基 半 固 体 培 养 基 2021/6/16 16 l 嗜 冷 菌 （ 10-20 ）l 嗜 温 菌 （ 20-40 ） ： 绝 大 多 数 病 原 菌l 嗜 热 菌 （ 50-60 ）二 、 适 宜 的 温 度 2021/6/16 17 嗜 中 性 菌 （ pH 6.0-8.0） 嗜 酸 性 菌 （ pH 8.5） 多 数 病 原 菌 最 适 酸 碱 度 为 pH 7.2-7.6 霍 乱 弧 菌 耐 碱 (pH 8.4-9.2) 结 核 分 枝 杆 菌 耐 酸 (pH 6.5-6.8)三 、 适 宜 的 酸 碱 度 （ pH） 2021/6/16 18 氧 和 二 氧 化 碳1、 按 细 菌 对 氧 的 需 求 可 分 为 四 种 类 型 ：u 专 性 需 氧 菌 （ obligate aerobe）u 兼 性 厌 氧 菌 （ facultative anaerobe）u 微 需 氧 菌 （ microaerophilic bacterium）u 专 性 厌 氧 菌 （ obligate anaerobe）四 、 适 宜 的 气 体 环 境 2021/6/16 19 2、 细 菌 的 二 氧 化 碳 培 养 法烛 缸 法二 氧 化 碳 孵 箱 某 些 细 菌 （ 脑 膜 炎 双 球 菌 、 淋 球 双 球 菌 、 布 氏 杆菌 等 少 数 细 菌 ） 的 生 长 ， 需 在 孵 育 时 加 入 5-10% CO2示 教 2021/6/16 20 1. 细 菌 的 接 种 法 ： 液 体 、 半 固 体 、 固 体 培 养 基2. 空 气 中 细 菌 的 检 查 （ 沉 降 法 ， 血 平 板 ）3. 呼 吸 道 细 菌 的 检 查 （ 咳 碟 培 养 ， 血 平 板 ）4. 随 身 物 品 细 菌 检 查 （ 普 通 平 板 ）操 作 内 容 2021/6/16 21 细 菌 的 分 离 接 种 是 人 工 分 离 培 养 细 菌 的 重 要 步骤 ， 是 微 生 物 学 的 基 本 技 术 之 一 ， 其 目 的 是 从 含 多种 细 菌 的 患 者 标 本 中 分 离 出 单 一 病 原 菌 ， 从 而 可 以进 行 感 染 性 疾 病 的 病 原 学 诊 断 。 同 时 ， 在 细 菌 学 的 研 究 ， 生 物 制 品 如 疫 苗 、 类毒 素 、 抗 毒 素 和 免 疫 血 清 等 的 制 备 ， 基 因 工 程 及 工农 业 生 产 等 方 面 ， 人 工 培 养 分 离 细 菌 ， 都 有 着 极 为重 要 的 意 义 。 操 作 一 细 菌 的 接 种 法 2021/6/16 22 琼 脂 平 板 划 线 分 离 接 种 法 （ 固 体 培 养 基 ） 划 线 法 斜 面 培 养 基 接 种 法 （ 蛇 形 划 线 法 ） 半 固 体 培 养 基 接 种 法 （ 穿 刺 法 ） 液 体 培 养 基 接 种 法 （ 乳 磨 法 ） 接 种 时 要 注 意 无 菌 操 作 ， 避 免 污 染 ， 也 要 防 止 细 菌外 溢 污 染 环 境 。细 菌 的 分 离 接 种 方 法 2021/6/16 23 固 体 平 板 培 养 基 的 划 线 接 种三 线 法 2021/6/16 24划 线 接 种 手 法 2021/6/16 25 平 板 划 线 接 种 的 结 果 菌 落 观 察1 固 体 平 板 培 养 结 果 观 察 单 个 微 生 物 在 适 宜 的 固 体 培 养 基 表 面 生 长 、繁 殖 到 一 定 程 度 ， 可 以 形 成 肉 眼 可 见 的 有 一 定形 态 结 构 的 细 菌 集 团 ， 称 为 菌 落 （ colony） 。 菌 落 特 征 是 鉴 别 细 菌 的 重 要 依 据 之 一 。 2021/6/16 26肺炎克雷伯菌奇异变形杆菌 菌 落 形 态 链球菌 2021/6/16 27 斜 面 培 养 基 接 种 蛇 形 划 线 2021/6/16 28 半 固 体 培 养 基 的 穿 刺 接 种 及 结 果 观 察 2021/6/16 29 液 体 培 养 基 的 乳 磨 接 种 手 法 2021/6/16 30 液 体 培 养 结 果 观 察 表面生长 沉淀生长 混浊生长 2021/6/16 31 空 气 中 没 有 营 养 物 质 ， 且 受 日 光 中 紫 外 线 的 作用 ， 细 菌 一 般 不 能 繁 殖 。 然 而 ， 土 壤 中 有 大 量 的 细菌 存 在 ， 可 随 尘 埃 散 布 到 空 气 中 ； 寄 生 在 人 和 动 物呼 吸 道 及 消 化 道 中 的 细 菌 也 能 通 过 各 种 途 径 散 布 到空 气 中 ， 使 得 空 气 中 也 有 一 定 量 的 细 菌 存 在 。 空 气 中 细 菌 的 数 量 和 种 类 随 地 区 、 季 节 和 人 口密 度 的 不 同 而 不 同 。 通 常 ， 可 测 定 单 位 体 积 空 气 中所 含 细 菌 的 数 量 来 评 价 空 气 的 污 染 程 度 。操 作 二 空 气 中 细 菌 的 检 查 2021/6/16 32 沉 降 法 是 利 用 含 有 细 菌 的 尘 粒 或 气 溶 胶 粒 因 重力 作 用 自 然 下 降 到 培 养 基 表 面 ， 通 过 细 菌 培 养 ， 计数 菌 落 数 ， 粗 略 评 估 空 气 中 细 菌 含 量 。 沉 降 法 简 单 易 行 ， 缺 点 是 不 够 准 确 。 但 它 客 观地 反 映 了 空 气 污 染 的 程 度 和 卫 生 通 风 状 况 ， 对 手 术室 、 食 品 业 等 有 重 要 的 参 考 意 义 ， 是 判 断 空 气 污 染的 指 标 之 一 。 2021/6/16 33 操 作 ： 将 血 平 板 打 开 盖 ， 放 到 教 室 的 四 个 角 上 ，静 止 15分 钟 后 ， 合 上 盖 送 37 孵 箱 培 养 。 据 推 算 ， 每 100cm培 养 基 在 空 气 中 暴 露 5min，其 表 面 接 受 自 然 沉 降 的 细 菌 数 约 相 当 于 10升 空 气 中所 含 的 细 菌 量 。 那 么 ， 暴 露 于 空 气 中 15min应 相 当于 30升 ， 所 以 ， 每 m空 气 中 活 菌 数 =（ 100 cm培 养基 上 菌 落 平 均 数 /30） x1000注 意 ： 计 数 菌 落 时 ， 两 个 或 几 个 菌 落 边 缘 有 重 叠 者 ， 均分 别 计 算 为 两 个 或 几 个 。 2021/6/16 34 人 体 呼 吸 道 与 外 界 相 通 ， 常 常 有 不 同 种 类 的 细菌 存 在 。 其 中 ， 1/4为 需 氧 菌 ， 3/4为 厌 氧 菌 。 这 些细 菌 常 是 条 件 致 病 菌 ， 在 一 般 情 况 下 并 不 致 病 。 有时 ， 正 常 人 的 呼 吸 道 中 也 有 致 病 菌 的 存 在 ， 如 肺 炎球 菌 、 脑 膜 炎 球 菌 、 乙 型 链 球 菌 、 流 感 杆 菌 等 ， 是引 起 疾 病 传 播 的 一 个 重 要 因 素 。 由 于 寄 居 人 体 的 关 系 ， 这 些 细 菌 对 营 养 的 要 求较 高 ， 常 需 要 用 含 血 液 成 分 的 培 养 基 进 行 分 离 。操 作 三 呼 吸 道 细 菌 的 检 查 咳 碟 试 验 2021/6/16 35 操 作 方 法 ： 打 开 血 平 板 ， 将 平 板 置 于 口 腔 前 约 15cm处 ，对 准 培 养 基 表 面 用 力 咳 嗽 3 4次 ， 然 后 盖 好 平 板盖 ， 放 置 于 37 孵 箱 内 培 养 24小 时 后 观 察 结 果 。结 果 判 断 ： 平 板 上 可 有 不 同 的 菌 落 长 出 ， 观 察 菌 落 的 形态 、 大 小 及 溶 血 现 象 。 2021/6/16 36 人 体 的 皮 肤 表 面 有 多 种 细 菌 存 在 ， 用 水 洗 手或 用 肥 皂 洗 手 ， 可 以 除 去 皮 肤 上 的 污 垢 和 灰 尘 ，从 而 减 少 手 上 细 菌 数 量 ， 但 并 不 能 有 效 的 杀 死 细菌 。 日 常 医 疗 、 试 验 工 作 中 常 用 的 化 学 消 毒 剂 如碘 酒 、 酒 精 等 有 很 好 的 杀 菌 作 用 ， 在 临 床 医 疗 中广 泛 应 用 。操 作 四 正 常 人 体 皮 肤 及 随 身 物 品 的 细 菌 检 查 2021/6/16 37 1、 在 平 板 底 部 用 笔 划 分 8个 区 ， 分 别 标 记 为 。2、 用 右 手 食 指 在 区 上 轻 轻 按 一 下 ， 然 后 用 肥 皂 洗 手 后 ， 用 无菌 棉 签 拭 干 手 指 皮 肤 ， 再 轻 轻 在 区 培 养 基 上 按 一 下 。3、 用 左 手 食 指 轻 轻 在 区 按 一 下 ， 然 后 用 棉 签 蘸 碘 酒 、 酒 精 消毒 左 手 食 指 皮 肤 ， 待 干 后 轻 轻 在 区 按 一 下 。4、 任 取 随 身 物 品 在 区 各 按 一 下 。5、 盖 好 平 板 ， 送 37 孵 箱 培 育 24小 时 后 观 察 结 果 。操 作 方 法 2021/6/16 38 1.细 菌 接 种 的 方 法 有 哪 些 ？ 各 有 什 么 用 途 ？2.厌 氧 菌 为 什 么 在 有 氧 环 境 中 不 能 生 长 ？思 考 题 2021/6/16 39 谢 谢 ！ 若有不当之处，请指正，谢谢！