血清学反应试验PPT课件

血 清 学 试 验 血 清 学 试 验血 清 学 鉴 定 ：用 已 知 抗 体 鉴 定 未 知 的 细 菌 或 标 本 中 的 抗 原血 清 学 诊 断 ：用 已 知 抗 原 检 测 血 清 中 的 特 异 性 抗 体 抗 原 （ antigen）是 一 类 能 刺 激 人 或 动 物 机 体 产 生 抗 体 或 致 敏淋 巴 细 胞 （ 免 疫 原 性 ） ， 并 能 与 这 些 产 物 在体 内 或 体 外 发 生 特 异 性 反 应 的 物 质 （ 反 应 原性 ） 。 （ 一 ） 抗 原 的 性 质1.异 物 性 异 种 间 的 物 质同 种 异 体 间 的 物 质 眼 睛 水 晶 体 蛋 白 质 、 精 细 胞 及 甲 状 腺 球 蛋 白 等自 体 内 隔 绝 物 质 ：抗 原 的 性 质 抗 原 的 性 质3.立 体 化 学 结 构 ： 一 般 分 子 结 构 和 空 间 构 象 愈 复 杂的 物 质 ， 免 疫 原 性 愈 强 。4.抗 原 决 定 族 antigenic determinant(抗 原 分 子 表面 上 的 具 有 一 定 化 学 组 成 和 结 构 的 特 殊 化 学 基 团 )决 定 其 特 异 性2.分 子 量 足 够 大 ： 一 般 104道 尔 顿 抗 原 决 定 族 人 工 抗 原天 然 抗 原合 成 抗 原 异 种 抗 原同 种 异 体 抗 原自 身 抗 原 核 酸 抗 原蛋 白 质 抗 原脂 抗 原多 糖 抗 原抗 原 种 类抗 原 的 种 类半 抗 原 （ 只 有 反 应 原 性 而 无 免 疫 原 性 ）完 全 抗 原 微 生 物 抗 原 成 分 -细 菌 抗 原 成 分菌 体 抗 原 :革 兰 氏 阴 性 菌 的 菌 体 抗 原 称 O抗 原 -脂多 糖 蛋 白 质 的 复 合 物 微 生 物 抗 原鞭 毛 抗 原 称 为 H抗 原表 面 抗 原 :不 同 细 菌 的 表 抗 原 名 称 不 同 .大 肠 杆 菌 的表 面 抗 原 称 为 封 套 抗 原 或 K抗 原 ,肺 炎 双 球 菌 的 叫 荚 膜抗 原 ,伤 寒 沙 门 氏 菌 的 表 面 抗 原 称 为 Vi抗 原 细 菌 抗 原细 菌 的 各 种 抗 原 微 生 物 抗 原颗 粒 抗 原组 分 抗 原可 溶 性 抗 原微 生 物 抗 原 成 分 -病 毒 抗 原 成 分 抗 体是 由 抗 原 刺 激 人 体 或 动 物 体 的 B细 胞 ,由 B细 胞 转 化 成浆 细 胞 所 产 生 的 具 有 特 异 性 的 免 疫 球 蛋 白(immunoglobulin,缩 写 为 Ig)抗 体 (antigen) 抗 体 种 类Ig ： 存 在 于 血 清 （ 占 血 清 免 疫 球 蛋 白 总 量的 80%） 和 组 织 液 中 。抗 体 的 结 构 和 种 类IgA： 二 体IgD：IgE：IgM： 五 体 IgG 结 构 IgA结 构Ig ： 存 在 于 血 清 （ 占 血 清 免 疫 球 蛋 白 总 量 的 13%）和 外 分 泌 液 中 IgM 等 结 构Ig ： 血 液 中 Ig ： 血 清 中 ， 1%Ig ： 血 清 中 ， 0.002% 抗 体 的 产 生 部 位淋 巴 器 官 一 级 淋 巴 器 官二 级 淋 巴 器 官 胸 腺骨 髓(鸟 )法 氏 囊淋 巴 结 （ 约 500-600个 ）脾 脏 抗 体 在 人 体 中 产 生 部 位 thymus Bone marrowspleenLymph node 抗 体 的 存 在 部位 :血 清 、 乳 汁 、体 液 抗体作用 抗 体 依 赖 性 细 胞 介 导 的 细 胞 毒 作 用（ ADCC） 抗 原 抗 体 反 应抗 原 抗 体 反 应 （ antigen-antibodyreaction） 是 指 抗 原 与 相 应抗 体 之 间 所 发 生 的 特 异 性 结 合 反 应 。 可 发 生 于 体 内 （ invivo） ，也 可 发 生 于 体 外 (invitro)。 体 内 反 应 可 介 导 吞 噬 、 溶 菌 、 杀 菌 、中 和 毒 素 等 作 用 ； 体 外 反 应 则 根 据 抗 原 的 物 理 性 状 、 抗 体 的 类型 及 参 与 反 应 的 介 质 （ 例 如 电 解 质 、 补 体 、 固 相 载 体 等 ） 不 同 ，可 出 现 凝 集 反 应 、 沉 淀 反 应 、 补 体 参 与 的 反 应 及 中 和 反 应 等 各种 不 同 的 反 应 类 型 。 因 抗 体 主 要 存 在 于 血 清 中 ， 在 抗 原 或 抗 体的 检 测 中 多 采 用 血 清 作 试 验 ， 所 以 体 外 抗 原 抗 体 反 应 亦 称 为 血清 反 应 （ erologicreaction） 。 抗 原 抗 体 反 应 条 件抗 原 抗 体 反 应 条 件1. 抗 原2. 抗 体3. 环 境 因 素 ：（ 1） 电 介 质 ： 0.85%NaCI；（ 2） 温 度 ： 37或 56（ 3） pH值 ： 7.0（ 4） 振 荡 ： 适 当 的 机 械 振 荡 （ 5） 反 应 时 间 抗 原 抗 体 反 应 一 般 规 律特 异 性 和 交 叉 性 若 两 种 抗 原 之 间 含 有 部 分 共 同 抗 原 时 ， 则 发 生 交 叉 反应 。 亲 缘 关 系 越 近 ， 交 叉 反 应 的 程 度 也 越 高 。反 应 的 可 逆 性 抗 原 与 抗 体 的 结 合 为 分 子 表 面 的 结 合 ， 结 合 的 适 宜 温度 为 0 40 、 pH在 4.0 9.0范 围 内 。 如 温 度 超 过60 或 pH降 到 3.0以 下 ， 或 加 入 解 离 剂 台 硫 氰 化 钾 、尿 素 等 ， 则 抗 原 抗 体 复 合 物 又 可 重 新 解 离 ， 解 离 后 的抗 原 或 抗 体 性 质 不 改 变 。 抗 原 抗 体 反 应 一 般 规 律最 适 比 和 带 现 象 只 有 抗 原 与 抗 体 呈 适 当 比 例 时 ， 才 可 出 现 可 见 的 结 合反 应 。 当 抗 原 过 多 或 抗 体 过 多 ， 则 抗 原 抗 体 的 结 合 不 能 形 成大 的 复 合 物 ， 因 而 抑 制 可 见 反 应 的 出 现 ， 这 一 现 象 称为 带 现 象 。 抗 体 过 多 出 现 的 抑 制 现 象 称 前 带 现 象 ， 而 抗 原 过 多 出现 的 抑 制 现 象 称 后 带 现 象 。 为 了 克 服 带 现 象 ， 在 进 行 血 清 学 试 验 时 ， 需 将 抗 原 或抗 体 作 适 当 稀 释 。 抗 原 抗 体 反 应 一 般 规 律反 应 的 二 阶 段 性 结 合 阶 段 -反 应 发 生 快 ， 几 秒 钟 至 几 分 钟 。反 应 阶 段 -较 慢 ， 需 几 分 钟 、 几 十 分 钟 或 更 长 时间 。 凝 集 反 应颗 粒 性 抗 原 （ 如 细 菌 、 红 血 球 等 ） 或 吸 附 在 乳 胶 、白 陶 土 、 离 子 交 换 树 脂 和 红 细 胞 的 抗 原 与 其 特 异 性抗 体 结 合 后 ， 在 有 电 介 质 存 在 时 ， 凝 聚 成 肉 眼 可 见的 凝 集 小 块 。 凝 集 原 凝 集 素直 接 凝 集 反 应 玻 片 法试 管 法抗 原 抗 体 反 应 类 型 -凝 集 反 应 血 清 凝 集 试 验 间 接 凝 集 反 应将 可 溶 性 抗 原 （ 或 抗 体 ） 吸 附 于 与 免 疫 无 关 的 小颗 粒 （ 载 体 ） 表 面 ， 加 入 相 应 的 抗 体 （ 或 抗 原 ） ，在 适 宜 条 件 下 ， 发 生 凝 集 反 应 。载 体 ： 动 物 的 红 血 球 ； 聚 苯 乙 烯 乳 胶 ； 矽 酸 铝 ；活 性 炭 等 。抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 间 接 血 凝 试 验间 接 血 凝 试 验吸 附 抗 原 的 红 细 胞 就 称 为 致 敏 红 细 胞 。 致 敏 红 细 胞与 相 应 抗 体 结 合 后 ， 能 出 现 红 细 胞 凝 集 现 象 。 用 已 知 抗 原 吸 附 于 红 细 胞 上 检 测 未 知 抗 体 称 为 正 向间 接 血 凝 试 验 ， 用 已 知 抗 体 吸 附 于 红 细 胞 上 鉴 定 未知 抗 原 称 为 反 向 间 接 血 凝 试 验 。 常 用 的 红 细 胞 有 绵 羊 、 家 兔 、 鸡 及 人 的 O型 红 细 胞 。 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 间 接 血 凝 抑 制 试 验间 接 血 凝 抑 制 试 验 抗 体 与 游 离 抗 原 结 合 后 就 不 能 凝 集 抗 原 致 敏 的 红细 胞 ， 从 而 使 红 细 胞 凝 集 现 象 受 到 抑 制 ， 这 一 试验 被 称 为 间 接 血 凝 抑 制 试 验 。抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 乳 胶 凝 集 试 验乳 胶 凝 集 试 验 以 乳 胶 颗 粒 作 为 载 体 的 间 接 凝 集 试 验 ， 称 为乳 胶 凝 集 试 验 。 该 试 验 既 可 检 测 相 应 的 抗 体 也 可鉴 定 未 知 的 抗 原 ， 而 且 方 法 简 便 、 快 速 ， 在 临 床诊 断 中 广 泛 应 用 于 伪 狂 犬 病 、 流 行 性 乙 型 脑 炎 、钩 端 螺 旋 体 病 、 猪 细 小 病 毒 病 、 猪 传 染 性 萎 缩 性鼻 炎 、 禽 衣 原 体 病 、 山 羊 传 染 性 胸 膜 肺 炎 、 囊 虫病 等 的 诊 断 。 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 协 同 凝 集 试 验协 同 凝 集 试 验 葡 萄 球 菌 A蛋 白 是 大 多 数 金 黄 色 葡 萄 球 菌 的特 异 性 表 面 抗 原 ， 能 与 多 种 哺 乳 动 物 血 清 中 的IgG分 子 的 Fc片 段 相 结 合 ， 结 合 后 的 IgG仍 保 持 其抗 体 活 性 。 当 这 种 覆 盖 着 特 异 性 抗 体 的 葡 萄 球 菌与 相 应 抗 原 结 合 时 ， 可 以 相 互 连 接 引 起 协 同 凝 集反 应 ， 在 玻 板 上 数 分 钟 内 即 可 判 定 结 果 (加 图 图八 )。 目 前 已 广 泛 应 用 于 快 速 鉴 定 细 菌 、 霉 形 体 和病 毒 等 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 碳 粉 凝 集 试 验炭 粉 凝 集 试 验 以 极 细 的 活 性 炭 粉 作 为 载 体 的 间 接 凝 集 试 验 ，称 为 炭 粉 凝 集 试 验 。 反 应 在 玻 板 上 或 塑 料 反 应 盘进 行 ， 数 分 钟 后 即 可 判 定 结 果 。 通 常 是 用 抗 体 致敏 炭 粉 颗 粒 制 成 炭 素 血 清 ， 用 以 检 测 抗 原 ， 如 马流 产 沙 门 氏 菌 ； 也 可 用 抗 原 致 敏 炭 粉 ， 用 以 检 测抗 体 ， 如 腺 病 毒 感 染 、 沙 门 氏 菌 病 、 大 肠 杆 菌 病 、囊 虫 病 等 的 诊 断 。 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -间 接 凝 集 反 应 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -沉 淀 反 应（ precipitation reaction)可 溶 性 抗 原 （ 如 细 菌 的 外 毒 素 、 内 毒 素 、 菌 体 裂解 液 、 病 毒 的 可 溶 性 抗 原 、 血 清 、 组 织 浸 出 液 等 ）与 相 应 的 抗 体 结 合 ， 在 适 量 电 介 质 存 在 下 ， 形 成肉 眼 可 见 的 细 微 的 白 色 沉 淀 。 抗 原 抗 体 反 应 类 型 -沉 淀 反 应（ precipitation reaction)可 溶 性 抗 原 +相 应 抗 体 肉 眼 可 见 的 沉 淀 沉 淀 反 应环 状 沉 淀 反 应絮 状 沉 淀 反 应 抗 原沉 淀 环抗 血 清抗 原 抗 血 清 混合抗 原 抗 体 反 应 类 型 -沉 淀 反 应常 用 于 毒 素 、 类 毒 素和 抗 毒 素 的 定 量 测 定 主 要 用 于 抗 原 的 定 性 试 验 ， 如 炭 疽病 的 诊 断 （ Ascoli氏 试 验 ） 、 链 球菌 的 血 清 型 鉴 定 和 血 迹 鉴 定 等 沉 淀 反 应沉 淀 反 应 -凝 胶 扩 散 试 验 ： 1%琼 脂 凝 胶 的 孔 径约 85毫 微 米 ， 可 允 许 各 种 抗 原 抗 体 自 由 扩 散 。 由 近 及 远 形 成浓 度 梯 度 。单 向 单 扩 散单 向 双 扩 散 抗 原抗 血 清 +琼 脂抗 原琼 脂抗 血 清 +琼 脂 沉 淀 反 应沉 淀 反 应 -琼 脂 扩 散 试 验 ：双 向 单 扩 散双 向 双 扩 散 抗 血 清 +琼 脂抗 原沉 淀 线 孔 径 3mm 抗 原待 检 血 清标 准 阳 性 抗 血 清 单 向 免 疫 扩 散 A： Ag、 Ab浓 度 及 扩 散 率 近 似 ； B ： Ag、 Ab浓 度 近 似 ， 扩 散 率 Ag Ab ；C： Ag、 Ab浓 度 近 似 ， 扩 散 率 Ag Ab ； D： 扩 散 率 近 似 ， 浓 度 Ag Ab ； E：浓 度 Ag Ab， 扩 散 率 Ag Ab ； F： 浓 度 Ag Ab， 扩 散 率 Ag Ab沉 淀 线 形 状 、 位 置 与 抗 原 抗 体 扩 散 率 及 浓 度 的 关 系双 向 琼 脂 扩 散 (1) 沉 淀 线 吻 合 ： 待 检 抗 原 与标 准 抗 原 完 全 相 同 。(2) 沉 淀 线 相 切 ： 待 检 抗 原 中含 有 与 标 准 抗 原 相 同 的 抗 原 ，还 含 有 另 外 的 抗 原 与 抗 血 清 相对 应 。(3) 沉 淀 线 相 交 ： 待 检 抗 原 有与 抗 血 清 对 应 的 抗 原 ， 但 和 标准 抗 原 不 同 。(4) 沉 淀 线 部 分 吻 合 ： 待 测 抗原 和 标 准 抗 原 性 质 相 同 ， 但 含量 较 低 。A1： 待 检 抗 原 ； A2： 标 准 抗 原双 响 琼 脂 扩 散 抗 体 效 价 滴 定用 梅 花 型 孔 ， 中 间 放 抗 原 ，周 围 孔 放 下 不 同 稀 释 度 的相 应 抗 体 ， 以 出 现 沉 淀 线的 最 高 稀 释 倍 数 为 该 抗 体的 效 价 。 对 流 免 疫 电 泳在 pH为 8.6的 琼 脂 凝 胶 板 上 打 孔 ， 两 孔 为 一 组 ， 孔 径 3mm， 抗 原 、抗 体 孔 间 距 为 4 5mm。 将 抗 原 加 入 负 极 端 孔 内 ， 抗 体 加 入 正 极端 孔 内 ， 用 2 4mA/cm电 流 电 泳 1h左 右 ， 观 察 结 果 ， 在 两 孔 之间 出 现 沉 淀 带 的 为 阳 性 反 应 。 在 pH8.6的 琼 脂 凝 胶 中 ， 抗 体 球 蛋 白 因 等 电 点 高 ， 只带 有 微 弱 的 负 电 荷 ， 而 且 分 子 又 较 大 ， 因 此 电 泳 力 小 ，小 于 电 渗 力 ， 泳 向 负 极 ； 而 一 般 抗 原 蛋 白 质 常 带 较 强的 负 电 荷 ， 分 子 较 小 ， 电 泳 力 大 ， 大 于 电 渗 力 ， 泳 向正 极 ， 电 泳 时 抗 原 放 负 极 侧 ， 抗 体 放 正 极 侧 ， 抗 原 抗体 相 对 泳 动 ， 一 定 时 间 后 抗 原 和 抗 体 将 在 两 孔 之 间 相遇 ， 在 比 例 适 当 处 形 成 肉 眼 可 见 的 沉 淀 线 。对 流 免 疫 电 泳 原 理 对 流 免 疫 电 泳 结 果 判 定 1为 阳 性2为 弱 阳 性3/4为 强 阳 性 对 流 电 泳 方 法 评 价简 便 、 快 速 、 敏 感 度 较 双 向 琼 脂 扩 散 试 验 高810倍 ， 但 分 辨 力 低 于 双 向 琼 脂 扩 散 试 验 。 火 箭 免 疫 电 泳 (rocket immunoelectrophoresis, RIE) 火 箭 免 疫 电 泳火 箭 免 疫 电 泳 是 单 向 单 扩 散 和 电 泳 技 术 相 结 合 的 一 种 血 清学 试 验 。 是 让 抗 原 在 电 场 的 作 用 下 ， 在 含 有 抗 体 的 琼 脂 中定 向 泳 动 ， 二 者 比 例 合 适 时 形 成 类 似 火 箭 样 的 沉 淀 峰 。 沉淀 峰 的 高 度 与 抗 原 的 浓 度 成 正 比 。 火 箭 免 疫 操 作 步 骤1. 制 备 抗 体 琼 脂 糖 凝 胶 板 将 已 融 化 的 1.2%巴 比 妥 缓 冲 琼 脂 糖 冷却 至 55 左 右 ， 加 入 适 量 抗 血 清 ， 混 匀 后 立 即 浇 板 ， 置 室 温 凝 固 。2. 打 孔 在 琼 脂 凝 胶 板 一 侧 打 孔 ， 孔 径 3mm， 孔 距 2mm。 置 琼 脂板 于 电 泳 槽 内 ， 搭 桥 后 用 微 量 注 射 器 准 确 加 样 10l。3. 电 泳 样 品 孔 放 负 极 侧 ， 电 压 810V/cm或 电 流 35mA/cm， 电泳 6h。4. 观 察 沉 淀 峰 电 泳 完 毕 后 ， 观 察 琼 脂 板 上 沉 淀 峰 ， 并 测 量 从 孔中 心 到 峰 尖 的 高 度 。5. 绘 制 标 准 曲 线 图 以 峰 高 为 纵 坐 标 ， 浓 度 为 横 坐 标 (对 数 坐 标 )，绘 制 标 准 曲 线 ， 求 出 待 检 样 品 内 抗 原 浓 度 火 箭 免 疫 结 果若 抗 原 与 抗 体 比 例 合 适 ， 则 孔 前 出 现 顶 端 完 全 闭 合 的火 箭 状 沉 淀 峰 ； 抗 原 大 量 过 剩 时 或 不 形 成 沉 淀 峰 ， 或沉 淀 峰 不 闭 合 ； 抗 原 中 等 过 剩 时 沉 淀 峰 呈 圆 形 ； 当 二者 比 例 不 适 当 时 ， 常 不 能 形 成 火 箭 状 沉 淀 峰 。 火 箭 免 疫 电 泳 方 法 评 价火 箭 电 泳 是 一 种 操 作 简 便 、 省 时 、 结 果 重 复 性 好 的定 量 检 测 方 法 。 其 敏 感 度 可 测 0.3mg/L抗 原 含 量 ，若 低 于 此 水 平 则 难 以 形 成 可 见 的 沉 淀 峰 。 如 加 入 少量 125I标 记 的 抗 原 在 含 抗 体 的 琼 脂 板 上 电 泳 ， 形 成的 不 可 见 火 箭 峰 ， 经 洗 涤 干 燥 后 ， 用 X线 胶 片 感 光 ，经 显 影 和 定 影 ， 可 呈 现 同 位 素 显 影 ， 这 就 是 放 射 自显 影 技 术 ， 可 用 于 微 量 抗 原 含 量 测 定 ， 如 测 定 血 清AFP或 IgE含 量 ， 可 测 至 g/L水 平 。 免 疫 电 泳 (immunoelectrophoresis, IEP)是 将 区 带 电 泳 和 双 向 琼 脂 扩 散 相 结 合 的 一 种 免 疫 化学 分 析 技 术 。 免疫电泳示意图 免 疫 电 泳 操 作 步 骤1. 取 洁 净 载 玻 片 ， 浇 注 融 化 的 琼 脂 凝 胶 ， 凝 固 后 打 孔 挖 槽 。2. 用 微 量 加 样 器 加 待 检 标 本 或 正 常 血 清 对 照 于 孔 内 。3. 电 泳 条 件 以 电 压 46V/cm或 电 流 23mA/cm为 宜 ， 电 泳1.52h。4. 电 泳 完 毕 后 ， 用 毛 细 滴 管 在 槽 内 加 入 含 相 应 抗 原 ， 孵 育 ，使 抗 原 抗 体 双 相 扩 散 ， 形 成 沉 淀 线 。5. 观 察 沉 淀 线 的 数 目 、 形 状 和 位 置 。 经 漂 洗 、 干 燥 、 染 色 、脱 色 等 步 骤 制 作 染 色 标 本 ， 可 长 期 保 存 。 例 如 血 浆 蛋 白 免疫 电 泳 。 免 疫 电 泳 方 法 评 价免 疫 电 泳 分 辨 率 高 ， 可 分 出 人 血 清 中 2030种 抗 原成 分 ， 可 鉴 定 混 合 抗 原 中 各 组 分 。 补 体 结 合 反 应补 体 特 点 ：补 体 可 与 任 何 抗 原 抗 体 复 合 物 结 合 ， 但 不 能 单 独 与抗 原 或 抗 体 结 合 。 在 有 特 异 抗 体 存 在 时 可 以 溶 解 细胞 （ 溶 菌 或 溶 血 ） 。抗 原 抗 体 反 应 类 型 -补 体 结 合 反 应有 补 体 参 加 的 抗 原 抗 体 反 应 。 补 体 结 合 反 应抗 原 + 抗 体 抗 原 抗 体 复 合 物补 体羊 红 细 胞 +溶 血 素 羊 红 细 胞 溶 血 素 复 合 物（ 不 溶 血 ）抗 原 + 抗 体 不 结 合羊 红 细 胞 +溶 血 素 羊 红 细 胞 溶 血 素 复 合 物 （ 溶 血 ） 补 体指 示 系 统 ：反 应 系 统 ： 补 体 结 合 反 应 标 记 抗 原 抗 体 反 应可 用 放 射 性 同 位 素 、 荧 光 素 或 酶 等 标 记 抗原 或 抗 体 。抗 原 抗 体 反 应 类 型-标 记 抗 原 抗 体 反 应 免 疫 荧 光 技 术是 用 荧 光 色 素 对 抗 体 或 抗 原 进 行 标 记 ， 再 与 相 应抗 原 或 抗 体 结 合 ， 然 后 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 荧 光 以分 析 示 踪 相 应 的 抗 原 或 抗 体 的 方 法 。常 用 的 荧 光 色 素 有 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ FITC） ，此 外 还 有 四 乙 基 罗 丹 明 （ RB200） 、 四 甲 基 异 硫 氰酸 罗 丹 明 （ TMRITC） 和 三 氯 三 嗪 基 氨 基 荧 光 素（ DTAF） 等 。 免疫荧光法 荧 光 标 记 法 抗 原抗 体 抗 原抗 抗 体抗 体 直 接 免 疫 荧 光 法间 接 免 疫 荧 光 法 酶 标 记 抗 体 技 术 （ 免 疫 酶 技 术 ）是 利 用 抗 原 抗 体 的 特 异 性 结 合 和 酶 的 高 效 特 异 的 催化 作 用 显 色 而 建 立 起 来 的 免 疫 检 测 技 术 。常 用 的 标 记 酶 是 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） ， 其 作 用底 物 为 过 氧 化 氢 ， 催 化 时 需 要 供 氢 体 ， 常 用 的 供 氢 体有 3， 3-二 氨 基 联 苯 胺 （ DAB） 和 邻 苯 二 胺 （ OPD） ，前 者 反 应 后 形 成 不 溶 性 的 棕 色 物 质 ， 适 用 于 免 疫 酶 组化 法 ； 后 者 反 应 后 形 成 可 溶 性 的 橙 色 产 物 ， 敏 感 性 高 ，易 被 酸 终 止 反 应 ， 呈 现 的 颜 色 可 数 小 时 不 变 ， 是ELISA中 常 用 的 供 氢 体 。 酶 标 记 抗 体 技 术 （ 免 疫 酶 技 术 ）直 接 法 用 酶 标 记 抗 体 直 接 处 理 含 待 检 抗 原 的 标 本 ， 洗 涤 后 浸 于 含有 过 氧 化 氢 和 DAB的 显 色 反 应 液 中 作 用 ， 然 后 在 普 通 光 学 显微 镜 下 观 察 颜 色 反 应 ， 抗 原 所 在 部 位 呈 棕 黄 色 。间 接 法 含 待 检 抗 原 的 标 本 先 用 未 标 记 的 抗 血 清 处 理 ， 洗 涤 后 再 用相 应 的 酶 标 记 抗 抗 体 处 理 ， 洗 涤 ， 然 后 浸 于 含 有 过 氧 化 氢 和DAB的 显 色 反 应 液 中 作 用 ， 普 通 光 学 显 微 镜 下 观 察 颜 色 反 应 ，以 指 示 是 否 有 抗 原 -抗 体 -抗 抗 体 复 合 物 存 在 。 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 （ 简 称 ELISA）将 抗 原 或 抗 体 吸 附 于 固 相 载 体 的 表 面 ， 酶 标 记物 与 相 应 的 抗 体 或 抗 原 反 应 后 ， 形 成 酶 标 记 抗 原抗 体 复 合 物 ， 在 遇 到 相 应 底 物 时 ， 结 合 物 上 的 酶催 化 底 物 产 生 水 解 、 氧 化 或 还 原 等 反 应 ， 从 而 生成 可 溶 性 或 不 溶 性 的 有 色 物 质 ， 可 用 肉 眼 或 酶 标测 定 仪 判 定 结 果 。 颜 色 的 深 浅 与 相 应 的 抗 体 或 抗原 量 成 正 比 ， 因 此 ， 可 根 据 颜 色 的 深 浅 来 定 量 抗体 或 抗 原 。 直 接 法将 已 知 抗 原 吸 附 在 固 相 载 体 表 面 ， 洗 除 未 吸 附 的抗 原 ， 加 入 一 定 量 的 酶 标 记 抗 体 与 样 品 (含 有 抗原 )提 取 液 的 混 合 液 ， 竞 争 温 育 后 ， 在 固 相 载 体表 面 形 成 抗 原 -抗 体 -酶 复 合 物 。 洗 除 多 余 部 分 ，加 入 酶 的 底 物 。 在 酶 的 催 化 作 用 下 ， 底 物 发 生 降解 应 ， 产 生 有 色 物 质 。 通 过 酶 标 检 测 仪 ， 测 出 酶底 物 的 降 解 量 ， 从 而 推 知 被 测 样 品 中 的 抗 原 量 。 间 接 法将 已 知 抗 原 吸 附 在 固 相 载 体 表 面 ， 洗 除 未 吸 附 抗 原 ，加 入 一 定 量 抗 体 与 待 测 样 品 (含 有 抗 原 )提 取 液 的 混合 液 ， 竞 争 温 育 后 ， 在 固 相 载 体 表 面 形 成 抗 原 -抗 体复 合 物 。 洗 除 多 余 抗 体 成 分 ， 然 后 加 入 酶 标 记 的 抗抗 体 ， 与 吸 附 在 固 体 表 面 的 抗 原 -抗 体 复 合 物 相 结 合 ，再 加 入 酶 的 底 物 。 在 酶 的 催 化 作 用 下 底 物 发 生 降 解反 应 ， 产 生 有 色 产 物 ， 通 过 酶 标 检 测 仪 测 出 酶 底 物的 降 解 量 ， 从 而 推 知 被 测 样 品 中 的 抗 原 量 。 斑 点 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 以 纤 维 素 薄 膜 为 固 相 载 体 ， 在 膜 上 进 行 免 疫 酶 反应 。 先 将 抗 原 或 抗 体 吸 附 在 纤 维 素 膜 的 表 面 ， 通过 相 应 的 抗 体 或 抗 原 和 酶 标 记 物 的 一 系 列 反 应 ，形 成 酶 标 记 抗 原 抗 体 复 合 物 ， 加 入 底 物 后 ， 结 合物 上 的 酶 催 化 底 物 使 其 水 解 、 氧 化 成 另 一 种 带 色物 质 ， 沉 着 于 抗 原 抗 体 复 合 物 吸 附 部 位 ， 呈 现 出肉 眼 可 见 的 颜 色 斑 点 ， 试 验 结 果 可 通 过 颜 色 斑 点的 出 现 与 否 和 色 泽 深 浅 进 行 判 定 。 免 疫 转 印 技 术 (immuno-blot)1979年 Towbin将 核 酸 转 印 技 术 （ Southern blot） 应 用 于蛋 白 质 研 究 ， 建 立 了 蛋 白 质 转 印 技 术 （ Western blot） 。免 疫 转 印 技 术 的 基 本 原 理 是 将 凝 胶 电 泳 与 固 相 免 疫 测 定 结 合起 来 ， 将 经 电 泳 分 区 的 蛋 白 质 精 确 且 近 似 定 量 地 转 移 到 固 相载 体 上 如 硝 酸 纤 维 素 膜 (NC膜 )， 并 保 持 其 原 有 的 生 物 活 性 ，再 经 荧 光 免 疫 、 酶 免 疫 、 放 射 免 疫 技 术 等 进 行 测 定 ， 可 得 以定 位 、 定 性 和 定 量 结 果 。 实 质 上 分 3步 骤 即 蛋 白 质 组 分 分 离 、各 组 分 转 印 及 免 疫 检 测 。 免 疫 转 印 技 术 操 作 步 骤1. 蛋 白 质 分 离 采 用 聚 丙 稀 酰 胺 凝 胶 电 泳(polyacryamide gel electrophoresis, PAGE)进 行 分离 。2. 蛋 白 质 转 印 从 凝 胶 上 将 蛋 白 质 转 移 至 NC膜 等 固 相 载 体 的 过 程 即 为 蛋 白 质 转 印 。 3. 蛋 白 质 的 免 疫 检 测 将 已 转 印 NC膜 封 闭 ， 用 酶 免 疫组 化 技 术 、 免 疫 金 组 化 技 术 等 检 测 。 免 疫 转 印 技 术 方 法 评 价免 疫 转 印 技 术 综 合 了 PAGE的 高 分 辨 力 和 免 疫 标 记 技术 的 高 度 特 异 性 和 敏 感 性 。 PAGE具 有 电 荷 效 应 、 分子 筛 效 应 和 浓 缩 效 应 ， 使 之 具 有 高 度 的 分 辨 力 ， 在 同一 固 相 载 体 上 可 作 多 项 成 分 的 分 析 。 中 和 试 验 病 毒 或 毒 素 与 相 应 抗 体 结 合 后 ， 丧 失 了 对 易 感 动物 、 鸡 胚 和 易 感 细 胞 的 致 病 力 ， 称 为 中 和 试 验 。 中 和 试 验中 和 试 验 免 疫 磁 珠 富 集 方 法 检 测 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157： H 7 检 样 25g 传 统 的 增 菌 培 养 取 一 定 量 的 增 菌 液 + Dynabeads anti- O 157磁 珠 反 应 一 定 时 间 在 磁 场 中 倒 掉 液 体 用 缓 冲 液 清 洗 几 次 收 集 磁 珠 + E.Coli O157复 合 体 在 选 择 性 培 养 基 上 进 行 培 养 优 点 ： 准 确 率 高 、 可 靠 、 灵 敏 度 高 ， 特 异 性 强 。 Thanks