生物显微镜技术6-显微操作技课件

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 显微操作技术,第六章 显微操作技术,显微操作技术,(micromanipulation technique),是在,20,世纪,60,年代后期随着细胞学实验、细胞核移植技术和医学界显微外科技术的开展而发展起来的。,显微操作技术具体是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器,(micromanipulator),进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。,显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植、显微切割、细胞膜打孔、外源基因显微注射导入等，是现代生物学重要的实验技能之一。,显微操作技术(micromanipulation techn,第一节 显微操作仪,显微操作仪目前使用较为广泛的有两类：,一类为球面、齿轮机械传动操作式，如德国,Leica,公司生产的,MicromanipulatorM,；,一类为液压传动操作式，如日本,Narishige,公司生产的,MO-IM,系列。,第一节 显微操作仪显微操作仪目前使用较为广泛的有两类：,Leica,转基因操作系统,LdcaASTP,实现了把光学显微镜和显微操作器的电控元件组合在同一控制部件内的第一台“转基因操作系统”。用同一个控制器可以同步调控显微镜和显微操作器。,Leica转基因操作系统 LdcaASTP实现了把光学显微,显微操作,(NARISHIGE),系统,Nikon,与,NARISHIGE,合作的结晶。*采用油压传动的远程驱动*针对不同用途，可灵活选择不同的配置方案,显微操作(NARISHIGE)系统 Nikon与NAR,显微操作仪的基本部件包括显微镜和显微操作器，附件配备有显微锻造器、拉针仪、吸管研磨器、微型注射器等。,常用于显微操作观察的显微镜有倒置显微镜、落射光或透射光显微镜及荧光显微镜等，其要求视场、工作距离大，最好配备有显微摄影装置或显微摄像装置，以便记录和分析。,显微操作仪的基本部件包括显微镜和显微操作器，附件配备有显微锻,1,、显微操纵器主机,主要有机械传动操纵式和液压传动操纵式两种。机械传动操纵式以,Leitz,公司生产的,MicromanipulatorM,为例。液压传动操纵式以,Narishige,公司生产的,MO-IM,为例。,1、显微操纵器主机 主要有机械传动操纵式和液压传动操纵式两种,2,、针具套管,Leica,公司生产的针具套管包括针具、紧固螺帽、引导圈、丝管和套管。,液压传动显微操纵器的针具套管及套管夹持固定装置与机械传动显微操纵器基本相同，但主要操作有所不同，它是通过液压传动装置而非机械球面微动传动。液压传动具有更稳定、操作简便及针具运作更安全的特点。,2、针具套管,针具、紧固螺帽、引导圈、丝管、套管,针具、紧固螺帽、引导圈、丝管、套管,3,、机械传动操作仪的操作步骤,(1),将显微镜及显微操作仪置于无震动的坚固实验台上，此时应注意避湿、避水和避免阳光直射。,(2),调整显微操作仪的倾斜标尺为“,0”,；调整显微操作仪，使其上罩盖和显微镜的载物台保持水平。,(3),调整针具套管上的针具进入显微镜视场中央，并使横轴粗调节轮左右、纵轴粗调节轮前后具有一定的调节动作范围，同时保持操纵杆和精细旋转调节柄相对垂直，以便获得适中的操作范围。通常垂直调节在,28mm,内，水平调节横轴粗调节轮在横向,16mm,内，纵轴粗调节轮在纵向,40mm,内，水平调节精细旋转调节在,0.1-4mm,之间可变，操纵杆总旋转度,40,，倾斜调节在,15,可调。,3、机械传动操作仪的操作步骤(1)将显微镜及显微操作仪置于,(4),针具进入视场中央后，进一步进行显微镜的进光和焦距等的调整，同时调整显微操作仪上各调节螺栓，使针具在显微镜的视场内能在前后、左右、上下及倾斜操作动作上均保持有合适的操纵范围。,(5),为了针具的安全操作，特别需要注意显微操作仪的横轴粗调节轮、纵轴粗调节轮上旋转调节柄的运作幅度及倾斜范围，通过操纵杆动静螺圈和幅度调节圈进行幅度控制及松紧调整，以获得满意的效果。,(6),操作完毕，针具退出视场，关闭光源，擦拭清洁显微镜及显微操作仪器，并给予保养，盖好防尘布罩。,(4)针具进入视场中央后，进一步进行显微镜的进光和焦距等的调,4,、显微操作仪附件设备,显微操作仪附件设备主要有显微针具锻造器、磨针器、拉针器、显微注射器及毛细玻璃管针具等。,4、显微操作仪附件设备显微操作仪附件设备主要有显微针具锻造,烧针器,主要是用来加热锻造玻璃管针具,烧针器,拉针器,拉针器,磨针器,研磨器主要是通过机械研磨将玻璃针尖加工成各种斜角、粗细角、钝锐角等,磨针器,生物显微镜技术6-显微操作技课件,专用硬质毛细玻璃管,(,如硼硅酸盐玻璃毛细管,),外径,lmm,，可以向专业厂商购置。利用针具锻造器、拉针器和研磨器及自制工具可以制作各种显微玻璃管针具,(,工具,),。针具制造需要积累经验，不断摸索创造，熟能生巧。,针具做好后竖插于放有海绵泡沫块的培养皿内，并用烧杯罩住。,专用硬质毛细玻璃管(如硼硅酸盐玻璃毛细管)外径lmm，可以向,第二节 几种显微操作技术简介,一、细胞核移植,细胞核移植（,nuclear transplantation,）就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程而经过无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。,就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个,细胞,里去。前者为供体，可以是,胚胎,的干细胞核，也可以是体细胞的核。受体大多是动物的,卵子,。因卵子的体积较大，操作容易，而且通过发育，可以把特征表现出来,第二节 几种显微操作技术简介 一、细胞核移植,细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质的功能，以及二者间的相互关系；探讨有关遗传，发育和,细胞分化,等方面的一些基本理论问题。,细胞核移植技术已有几十年的历史。,迄今为止，已有下面,9,种供核类型的体细胞核移植后代产生：胎儿成纤维细胞 、成体乳腺细胞 、卵丘,/,颗粒细胞 、输卵管,/,子宫上皮细胞 、肌肉组织的细胞 、成体耳部成纤维细胞、睾丸支持细胞 、小鼠尾尖细胞 、初乳的乳腺上皮细胞,细胞核移植技术，主要是用来研究胚胎发育过程中，细胞核和细胞质,克隆羊,“,多莉,”,克隆羊之父维尔莫特,克隆羊,“,多莉,”,和它生下的小羊,克隆羊“多莉”克隆羊之父维尔莫特 克隆羊“多莉”,细胞核移植技术流程,供体体细胞经细胞培养后，提取细胞核；,提取卵巢卵母细胞，在其减数分裂第二次分裂中期除去细胞核，制成无核细胞质；,将供体核与无核卵母细胞质融合，并培养成早期胚胎；,将早期胚胎移植到代孕母体子宫内，发育成新个体。,细胞核移植技术流程,去核,？,体细胞,去核的卵母细胞,重组细胞,重组胚胎,移入受体子宫,个体,？,物理、化学方法激活,供体细胞导入,体细胞核移植过程流程图,去核？体细胞去核的卵母细胞重组细胞重组胚胎移入受体子宫个体,动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体。,怎样获得克隆动物？,原理：细胞核全能性,技术支持：动物体细胞核移植技术,应用：加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育。保护濒危物种。生产医用蛋白。作为异种移植的细胞、组织或器官供体。用于组织器官的移植,、尚存问题：克隆动物存在遗传和生理缺陷。如体重较大、异常肥胖、发育困难、脏器缺陷、免疫失调等,动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。生产遗传结构,生物显微镜技术6-显微操作技课件,二、显微注射法和转基因动物,显微注射法（,microinjection,）是利用管尖极细（,0.1,至,0.5m,）的玻璃微量注射针，将某些微量物质（如外源基因片段）直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（,rearrangement,）、缺失（,deletion,）、复制（,duplication,）或易位（,translocation,）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。,二、显微注射法和转基因动物,显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和,/,或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。,这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的,mRNA,和,DNA,等等。,运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验,。,显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子,应用：,生殖研究（,ICSI,胞浆内单精子显微注射的技术，,“,第二代试管婴儿,”,，是在体外受精,-,胚胎移植,(IVF-ET),基础上发展起来的显微受精技术，通过直接将精子注射入卵母细胞胞浆内，来达到助孕目的；单精子卵胞浆内显微注射技术（,ICSI,）是在显微操作系统帮助下，在体外直接将单个精子注入卵母细胞浆内促其受精，发育成胚胎后将优质胚胎移植入女方子宫内，使其种植妊娠的技术。）；,培养细胞的转染，以建立稳定整合外源基因的细胞系。,应用：,单精子卵母细胞浆内显微注射授精,单精子卵母细胞浆内显微注射授精,转基因动物是指将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。,转基因动物的制作，可以利用基因微注射（,gene microinjection,）、胚干细胞（,embryonic stem cells,ES cells,）、精子载体（,sperm vector,）、反转录病毒感染（,retroviral vectorinfection,）及体细胞核移植（,somatic cell nucleartransfer,）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍且成功率较高之方法之一。,转基因动物是指将特定的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定,此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。,供体：某些微量物质（如外源基因片段），受体：胚胎或细胞。,此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛,大致过程,1,、采集受精卵：（,1,）超数排卵 。（,2,）取受精卵 。,2,、向受精卵雄性原核注入,DNA,溶液,3,、将,2,细胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中,4,、导入基因的鉴定,大致过程,生物显微镜技术6-显微操作技课件,转基因小鼠制备技术路线,转基因小鼠制备技术路线,生物显微镜技术6-显微操作技课件,注：中间小鼠即是含外源基因的嵌合体小鼠,注：中间小鼠即是含外源基因的嵌合体小鼠,转基因动物的应用,1,、,生命现象的基础理论研究,（,1,）发育生物学的研究,（,2,）遗传学研究,2,、医学研究,(1,）心血管疾病的研究。（,2,）肿瘤学研究。（,3,）遗传病研究。（,4,）免疫学研究。,3,、改良和培育动物新品种,4,、研制和生产生物活性物质,转基因动物的应用,原核显微注射受精卵之一,原核显微注射受精卵之一,原核显微注射受精卵之二,原核显微注射受精卵之二,胚胎干细胞显微注射到囊胚,胚胎干细胞显微注射到囊胚,三、胚胎分割,胚胎分割,:,（,Embryo bisection,）借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此 胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。,胚胎分割技术的应用，不仅可使胚胎移植所用胚胎数目成倍增加。而且可以产生遗传性能相同的后代。,同时应用胚胎分割技术还可以间接地控制性别，从而极大提高了胚胎移植的价值和实际效果。,三、胚胎分割,生物显微镜技术6-显微操作技课件,胚胎切割牛,胚胎切割牛,生物显微镜技术6-显微操作技课件,四、显微切割术,显微切割术,(microdissection),是,90,年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如,PCR,，,PCR,SSCP,及比较基因组杂交等。,四、显微切割术,1,、用于显微切割的组织切片可以是冰冻切片、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片。,2,、用于显微切割的组织切片还必须染色，以便于进行目标细胞群或单一细胞的定位。,3,、显微切割的方法有手工操作法和激光捕获显微切割,1、用于显微切割的组织切片可以是冰冻切片、石蜡包埋的组织切片,复习题,1,、显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植、显微切割、细胞膜打孔、外源基因显微注射导入等,2,、解释：细胞核移植、显微切割术（显微切割术,(,是,90,年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如,PCR,，,PCR,SSCP,及比较基因组杂交等。,),3,、显微注射应用的范围非常广泛，可以注射进细胞的物质包括哪些？（各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的,mRNA,和,DNA,等等。）,复习题1、显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、,