VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖黏附及侵袭的影响

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达及其对细胞增殖、黏附及侵袭的影响,田小飞,陕西省肿瘤医院妇瘤中心,研究背景,宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率在我国妇科恶性肿瘤中居首位。WHO报道：全世界发病人数为45万，我国估计年发病人数18万多，约占世界发病总数的1/3。,淋巴转移是宫颈癌的主要转移途径，也是宫颈癌治疗效果差、存活率低、复发和死亡的直接原因，成为影响患者预后的重要因素。,曹泽毅主编，中华妇产科学，2004,肿瘤淋巴转移是一个多步骤、多因素参与的及其复杂的过程,。近来随着特异性淋巴内皮标记的发现，,淋巴转移的研究成为继血管生成之后肿瘤研究的又一热点,，以期通过阻断肿瘤的淋巴转移，改善患者的预后。,目前对于肿瘤淋巴转移机制的研究,主要集中在,VEGF-C,特异性与受体,VEGFR-3,结合，诱导淋巴管生成，促进肿瘤的淋巴转移方面。,血管内皮生长因子-C,(vascular endothelial growth growth factor-C,VEGF-C)是新近发现的VEGF家族的新成员，是,特异性淋巴管生长因子。,在近50的人类恶性肿瘤中表达。,VEGFR-3一种酪氨酸激酶受体，,主要表达于正常组织的淋巴管内皮、新生的血管内皮及,人的肿瘤细胞。,M.A.A Al-Rawi.et al.Histology and Histopathology 2005,(Marc G.Achen et al.Cancer Cell.2005.),研究设想,VEGF-C,淋巴内,皮细胞,肿瘤细胞,?,肿瘤,淋巴,转移,实验方法,体外培养,Hela,细胞,脂质体介导寡核苷酸转染,24h,、,48h,、,72h,荧光定量,RT-PCR,检测,VEGF-CmRNA,MTT,法检测细胞生长,间接免疫荧光染色和流式,细胞术检测,VEGF-C,蛋白,黏附实验,Tanswell,小室侵袭实验,材料,1细胞株 人宫颈癌细胞株Hela由四川大学华西第二医院妇科肿瘤实验室提供。,2主要试剂及其配制,兔抗人VEGF-C多克隆抗体北京中山金桥生物,标记FITC羊抗兔二抗北京中山生物技术,Matrigel(美国Collaborative Research公司),ECM胶extracellular matrixE1270(美国Sigma公司),纤维粘连蛋白FNRoche公司,VEGF-C寡核苷酸：由北京赛百盛生物技术公司合成,反义链5-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3，,两端各3个碱基进行硫代修饰，目标核苷酸251271，在5端标记 FAM，,正义链5-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3，,两端各3个碱基进行硫代修饰。,阳离子脂质体 Lipofectamine2000美国Invitrogen公司，系尹如铁副教授惠赠,Transwell小室3428型，孔径8um，美国Corning-Costar公司,引物：VEGF-C及内参照GAPDH的引物均由上海生物工程合成，其氨基酸序列及其产物长度如下：,基因名称,核苷酸序列,产物长度,VEGF-C,上游引物,5-AGCTACCTCAGCAAGACGTTA-3,93bp,下游引物,5-GCAGGAAGTGTGATTGGCAAA-3,Taqman,探针,5-FAM TGCCTCTCTCTCAAGGCCCCA-TAMRA-3,GAPDH,上游引物,5-CCTCAAGATCATCAGCAAT-3,141bp,下游引物,5-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3,Taqman,探针,5-FAM-ACCACAGTCCATGCCATCAC-TAMRA-3,实验仪器,FTC2000 荧光定量基因扩增仪,MSE Micro-Centaur Centrifuge 微型台式离心机,水平电泳仪美国BIO-RAD公司,Gel Doc 1000凝胶成像系统,微量移液器法国Gilson公司,Elite Esp型流式细胞仪,VEGF-C,反义寡核苷酸的设计,反义寡核苷酸设计，首先是从美国国立图书馆的GENEBANK数据库中，查找到人VEGF-C的基因序列NM 005429。,根据设计原那么：长度在1520bp、修饰；G+C的比例：40%60%；防止4个碱基以上自身反向互补序列；防止4G堆积；防止六个以上的回文结构等。,设计反义链：5-GCC AGC CTC CTT TCC TTA GC-3；正义链：5-GCT AAG GAA AGG AGG CTG GC-3，为提高对核酶的抗性，在两条链的两端各3个碱基硫代修饰。,确定序列后，常规进行人类基因组同源性分析，即：通过Blast分析，证实两条链与人类其他以基因无同源性。,为便于观察寡核苷酸转入细胞的效率，在反义链5端标记了羧基荧光素(FAM)，FAM的激发波长是480nm，发射波长是520nm，在荧光显微镜下是绿色的。,MTT,法检测,Hela,细胞黏附能力的变化,包被基底膜,接种细胞,MTT比色法检测,黏附率OD值实验组OD值BSA组/OD值BSA组100,10g/L BSA；,50mg/L Matrigel1:2稀液；10mg/L FN，,以50ul/孔分别参加96孔培养板，4过夜，BSA为对照基底。,水化基底膜,吸取培养板中的液体，参加50ul含10g/L BSA的无血清高糖DMEM培养液，37，孵育30min。,细胞体外侵袭力测定,Transwell,高糖,DMEM,1:1,条件培养液,(NIH3T3),及高糖,DMEM2.5ml,ECM,包被孔径,8um,的滤膜,Hela,细胞,24h,、,48h,擦去上室中的细胞，,HE,染色，计数穿膜细胞数,.,三、统计学处理,所有资料均用SPSS10.0软件包进行处理，采用t检验和方差分析，检验水准定0.05，假设P0.05，认为差异具有统计学意义。,结 果,图,1 VEGF-C,在宫颈癌,Hela,细胞中的表达,LsAB,法,400,图,2 FAM,标记的反义寡核苷酸转染,Hela,细胞,6h,后,100,1,、,VEGF-C,在,Hela,细胞中的表达,2,、寡核苷酸转染后,VEGF-CmRNA,的变化,标准模板的荧光定量,PCR,标准曲线,VEGF-CCt,值,GAPDH Ct,值,Ct,Ct,抑制率,(%,）,24h,对照组,16.10,12.9,3.2,0,0,正义组,16.69,13.4,3.11,-0.09,-5.9,反义组,16.90,12.5,4.4,1.2,35.71,48h,对照组,16.5,13,3.5,0,0,正义组,16.9,13.5,3.4,-0.1,-6.6,反义组,19.5,14,5.5,2,72.3,72h,对照组,20.0,14.5,5.5,0,0,正义组,19.01,13.5,5.51,0.01,0.7,反义组,20.5,14,6.5,1,47.4,表,1,转染后细胞的,VEGF-C mRNA,的表达,在转染24h、48h、72h后，反义组VEGF-C mRNA的抑制率与对照组和正义组相比，差异均有显著性P0.05。,3.,寡核苷酸转染后,VEGF-C,蛋白的变化,分 组,24,小时,48,小时,72,小时,对照组,1.60,0.09,1.53,0.14,1.46,0.07,反义组,0.84,0.02*,0.40,0.01*,1.01,0.03*,正义组,1.34,0.11,1.50,0.07,1.53,0.05,表2 转染后细胞中VEGF-C蛋白表达平均荧光强度,*t=7.74 *t=26.94 *t=10.23,三个,p0.05,24h,24h,72h,48h,图3-5 VEGF-C反义寡核苷酸转染Hela细胞后VEGF-C蛋白的表达,平均荧光强度,4.,寡核苷酸转染后对,Hela,细胞生长的影响,分,组,24,小时,48,小时,72,小时,对照组,1.3060,0.9234,1.3484,0.1193,1.3742,0.0979,反义组,1.0034,0.0837,0.8042,0.1435,1.0146,0.1078,正义组,1.3384,0.1293,1.3740,0.0875,1.4232,0.0865,表,3,转染后各组细胞在不同时间段的,OD,值,5.,寡核苷酸转染对细胞黏附能力的影响,对照组,反义组,正义组,Matrigel,0.4586,0.0354,0.3424,0.0144,0.4178,0.0273,Fn,0.4462,0.0188,0.3192,0.0284,0.4374,0.0185,BSA,0.3750,0.0197,0.3232,0.0319,0.3718,0.0314,表4 细胞对基质成分的黏附能力光吸收值A,黏附率OD值实验组OD值BSA组/OD值BSA组100,图 8 Hela细胞黏附实验,图 9 VEGF-C反义寡核苷酸转染后Hela细胞黏附实验,6.,寡核苷酸转染细胞侵袭能力的影响,对照组,反义组,正义组,24,小时,87.4,8.15,70.6,5.85*,85.0,9.85,48,小时,146.3,14.20,96.1,15.07*,134.5,20.09,表,5,不同时间三组细胞的穿膜细胞数,*t=2.8055 *p0.05,；*,t=3.4190 *p0.05,图,11 Hela,细胞穿膜,48,小时,HE400,图,12,反义寡核苷酸转染后,Hela,细胞穿膜,48,小时,HE400,讨 论,1,VEGF-C,在,Hela,细胞中的表达,Ueda等研究了16种妇科肿瘤细胞的VEGF-C的表达和侵袭活性的关系，说明宫颈癌Hela细胞内VEGF-C高表达，具有更强的转移和侵袭能力。,本实验通过荧光定量RT-PCR法，检测到VEGF-C在mRNA水平的高表达;采用免疫细胞化学法及间接免疫荧光标记和流式细胞术，检测到VEGF-C在蛋白水平的高表达。与上述研究结果一致。,2.VEGF-C,反义寡核苷酸转染后对细胞 内,VEGF-C,的影响,反义寡核苷酸技术属于反义核酸的一种，是通过各种机制，在核酸水平上有效的关闭某一特定基因，抑制该基因的表达，从而到达说明目的基因功能的目的，进而成为特异性治疗疾病有效方法。,CohenJ S.Pharmacol T-her,1991,2.1 VEGF-C,反义寡核苷酸对细胞的,VEGF-C,mRNA,的影响,本实验证实：,VEGF-C,反义寡核苷酸能有效封闭,VEGF-C,基因，抑制了其在,Hela,细胞中,mRNA,水平的表达。,在,24h,、,48h,、,72h,三个时间点，,VEGF-C mRNA,的抑制率分别为,35.71,、,72.30,、,47.40,，,48h,抑制最为显著，,72h,抑制减弱。,反义寡核苷酸对VEGF-C mRNA抑制作用的时效性，说明反义寡核苷酸在72h被代谢失活，对VEGF-C的抑制作用逐渐被解除。,反义寡核苷酸抑制VEGF-C mRNA的表达，可能是通过Crooke等研究的反义寡核苷酸的作用机制：反义寡核苷酸与DNA双螺旋形成三螺旋，从而阻止DNA的转录。反义寡核苷酸与核内不均一RNA(hnRNA结合，使其不能正确的剪切，成熟mRNA不能形成。,2.2 VEGF-C,反义寡核苷酸对细胞,VEGF-C,蛋白,的影响,VEGF-C反义寡核苷酸转染后对细胞VEGF-C蛋白表达的影响与对细胞内VEGF-C mRNA的影响是一致的。,其可能的机理为：,反义寡核苷酸抑制了VEGF-C在mRNA水平的表达；进而影响VEGF-C在蛋白水平的表达。,有研究说明：反义寡核苷酸与mRNA、核糖体rRNA结合，蛋白质翻译就不能正确启动。,(Douglas WG,et al.Am Coll Surg,2000),3.VEGF-C,反义寡核苷酸对,细胞增殖,的影响,细胞增殖是转移的前题，本研究各组