流式细胞术样品制备(完整)课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,流式细胞术的样品制备,FCM,的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术，,FCM,是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。,FCM,的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在,FCM,技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。,一、单层培养细胞分散为单个细胞,贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备,操作步骤：,1,、将单层培养细胞,(,对数生长期,),中的旧培养液倒掉。,2,、加入少量,0.25%,胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有,10%,胎牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，,PBS,液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留,0.5ml,细胞悬液，用振荡器使细胞分散。,3,、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为,70%,乙醇，然后保存于,4,冰箱中。,（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备,操作步骤：,1,、离心去除旧培养液，,PBS,液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留,0.5ml,细胞悬液，用振荡器使细胞分散。,2,、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为,70%,乙醇，然后保存于,4,冰箱中。,二、实体组织单分散细胞的制备,新鲜实体组织,新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及时用固定剂或低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶，影响检测结果。,新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下,：,酶消化法,机械法,剪碎法,网搓法,研磨法,化学试剂处理法,酶消化法,酶对实体组织分散作用原理主要有三方面：,一是可以破坏组织间的胶原。,二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。,三是可以水解组织间的粘多糖物质。,酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用的酶类试剂有：,蛋白酶类，,(,如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等,),都能够释放所有组织中的细胞；,胰酶，能水解脂键和肽键；,胶原酶，能降解几种分子类型的胶原；,溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键；,弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。,为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素：,酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成 酶效价降低,注意组织在消化液中的消化时间,注意酶活性的,PH,值,注意酶的适用浓度,随时注意影响酶活性的其他因素,各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的，不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的结构或功能产生不利的影响。,酶学方法的一般程序：,将适合于酶消化的组织置于离心管中。,将选好的酶溶液,1-2ml,加入盛有被消化组织的试管中。,一般消化,20-30,分钟,(,恒温,37,C,或室温,),，消化期间要间接振荡或吹打。,终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网,(200,目,),过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。,将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。,机械法,机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使用。,常用的几种机械法制备过程如下：,剪碎法：,将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。,用剪刀将组织剪至匀浆状。,加入,10ml,生理盐水。,用吸管吸取组织匀浆，先以,100,目尼龙网过滤到试管中。,离心沉淀,1000prm3-5,分钟，再用生理盐水洗三次，每次以短时低速离心沉淀,(500-800prm),去除,细胞碎片。,以,300,目尼龙网过滤除去细胞团块。,70%,冰乙醇固定，放入,4,冰箱。,网搓法：,将,100,目铜网扎在小烧杯上。,把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。,用,300,目的,尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块,收集细胞悬液，离心沉淀,1000prm,，,5,分钟。,70%,乙醇固定，置,4,冰箱备用。,研磨法,准备一只,70ml,组织研磨器,将组织剪碎至小块。,放入组织研磨器中，加入,1-2ml,生理盐水。,转动研棒，研至匀浆即可。,加入生理盐水,10-20ml,，,冲洗研器。,收集细胞悬液，并经,300,目尼龙网过滤，离心沉淀,500-800prm,，,1-2,分钟，再用生理盐水洗三次，离心沉淀。,化学试剂处理法,化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用 的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。,试剂配制：,0.2%EDTA,配制,EDTA0.2g,溶解后，加入,Hank,s,液,100ml,，,封装高压消毒，置,0-4,保存。,胰酶加,EDTA,配制,胰酶,0.25g+PBS(PH7.0)200ml,，,浓度,0.125%,，,EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml,，,浓度,0.2%,。,各取,40ml,混合，分装置冰箱保存，用时过滤既可。,实验步骤：,将组织切成薄片放入试管。,加入,EDTA,液,5ml,，,室温，半小时，弃之。,加入胰酶,+EDTA,液,5-10ml,，在,37,恒温水浴,30,分钟，间断振荡,3-5,次。,用,300,目尼龙网过滤，离心沉淀,1000prm,，,5,分钟，再以生理盐水洗,2-3,次，离心,500-800prm,，,1-2,分钟。,70%,乙醇固定置冰箱中被检。,实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不单独使用，可与其他方法联合使用。,机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的细胞产量，为使细胞碎片不影响,FCM,检测结果，需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。,酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的，但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的,FCM,结果。,注意事项：,新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放置时间过长，造成细胞自溶导致,DNA,降解，影响,FCM,测定结果。,根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固定剂的原因，造成,FCM,检测结果的不稳定。,酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、,pH,值、浓度等方面对酶消化法的影响。,需注意不同的组织选用适当的方法，如富于细胞的肿瘤,(,淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌以及一些软组织肉瘤,),不一定要用酶学或化学法，往往用单独的机械法就可以收到大量单分散细胞。,在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原酶为好，因为胶原酶具有在,Ca,2,、,Mg,2,存在或在血清状态下不发生活性降低的特征。,实验方法：,石蜡包埋组织在切片机上切取,40-50,m,厚的组织片,3-5,片。,将切取的组织片放入试管中。,加入二甲苯,5-8ml,脱蜡,(,在室温下,),，,1-2,天，视石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后弃去二甲苯。,水化：依次加入,100%,、,95%,、,70%,、,50%,梯度的酒精,5ml,，,每步,10,分钟，去乙醇，加入蒸馏水,3-5ml,，,10,分钟后弃之。,消化：加入,2ml 0.5%,胃蛋白酶,(pH,值,1.5-2.0),置,37,恒温水浴中消化,30,分钟，消化期间每隔,10,分钟振荡一次。,石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,消化,30,分钟后，立即加入生理盐水终止消化。,经,300,目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以二次消化。,收集细胞悬液，离心沉淀,1500prm,，,以生理盐水漂洗,1-2,次，离心沉淀,1500prm,，再以,生理盐水漂洗,1-2,次，离心沉淀,500-800prm,，去,碎片。,制备好的单细胞悬液作涂片，,AO,染色在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核，核发出黄绿色荧光。,单细胞样品,110,6,细胞,/ml,，,加入荧光染液溴化乙啶,(EB),或碘化丙啶,(PI)1ml,，,置,0-4,冰箱,30,分钟，经,300,目尼龙网过滤后上机检测。,注意事项：,一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法是，弃去二甲苯，加入,100%,乙醇，如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则没有脱净。,消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉。,切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长，一般以,40-50,m,为宜。,二、血液单细胞样品的制备,血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态，它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象，因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来，下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。, 淋巴细胞的制备,取肝素抗凝血,2.0ml,，,用生理盐水,2ml,将全血稀释至,4ml,。,先将,3ml,人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态。,离心,2000prm,，,30,分钟，室温,18-20,，离心后可见试管内的血液清楚的分为,4,层，上层为血浆层，中层为分离液层,(,淋巴细胞所处的位置在血浆层与分离液层中间,),，底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。,用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一支离心管，用生理盐水稀释至,10ml,，,离心洗涤,2,次，每次均以,1500prm, 10,分钟，弃上清后即得到纯度较高的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。,70%,冰乙醇固定，置,4,冰箱保存。, 粒细胞的制备,用淋巴细胞分离液对细胞进行分层。,粒细胞的比重较淋巴细胞稍大，因此经分离液分离后的粒细胞，分层于红细胞之上，分离液的底部。,以吸管慢慢将粒细胞层吸出，置另一支离心管内，以,5ml,的,Hank,s,液洗涤三次，每次离心沉淀,1500prm,，,10,分钟。,在吸取粒细胞的同时常附带一些红细胞，因此需将红细胞去除，加入,1.0ml,低渗溶液，,30-40,秒。,再以,Hank,s,液洗涤,2,次，即可获得纯度大于,95%,以上的粒细胞。, 单核细胞制备,1. 取肝素1000,u/ml,抗凝全血3.,0,m1,加入3.0,ml,生理,盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。,2.1640,培养液,10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入,培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。,3.,放入,37,恒温箱内孵育,30-40,分钟,取出培养瓶,将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次,以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴附快的特,点,而其他细胞没有这个特性,所以利用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细胞。,4.,将粘附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来,用,0.25%,胰,酶消化,10,15,分钟,室温下,并不断摇震,以促使细胞脱落下,单核细胞的粘附力很强,用酶消化往往获得细胞数少,目前亦采用机械的方法,用一橡皮刷,伸入培养瓶在瓶壁上轻擦,将细胞刮取下,但切勿用力过大,造成细胞损伤过多。,5.,脱落下来的细胞移入离心管,离心沉淀,1500prm,5,分钟,再以生理盐水漂洗,2,3,次,每次离心,800prm,2,分钟,以去除碎片杂质。,6.,将细胞涂片,以,丫啶,橙染色,置荧光显微镜下观察形态和纯度。,7.,将细胞以,70%,乙醇固定,置,0-4,冰箱保存备检。,三、脱落细胞单细胞悬液的制备,在临床实际工作中,，,可收集到大量自然脱落的细胞,，,这些细胞标本经过简单的处理,，,就可得到较好的单分散细胞悬液,，,所以是流式细胞术检测的天然样品,，,下面介绍几种常见的脱落细胞样品制备方法。, 宫颈脱落细胞悬液,的,制备,1.,首先用生理盐水冲洗宫颈表面的分泌物,以海棉轻拭宫颈表面,将海棉中吸附的脱落细胞洗脱到,20ml,生理盐水中。,2.,收集细胞悬液,以,1500prm,离心沉淀,用生理盐水洗涤,2,次,每次,5,分钟,弃上清后加入,70%,乙醇,3ml,固定备检。,食管,脱落细胞悬液的制备,1.,将食管拉网器上的细胞洗脱到,10ml,生理盐水中,以,1500prm,离心沉淀,再用生理盐水洗涤,2,次,离心,500-800prm1-2,分钟,弃上清。,2.,调整细胞数在,1X10,6,/ml,可进行标记染色上机,如不马上检测可用,70%,的冰乙醇固定保存。,3.,在标记染色前如发现细胞有团块聚集,，,可用,0.5%,胃蛋白酶(,PH1.5-2.0),在,37,水浴箱中消化,5-10,分钟,，,振荡分散为单细胞悬液。,胸腹水,脱落细胞的制备,1.,抽取胸腹水,200-300ml,，,加入抗凝剂,(,肝素或,枸橼,酸,钠,)5ml,，,放入容器中置,4,冰箱静置,6-12,小时,，,弃上清。,2.,留取沉淀液,10-20ml,，,吸入试管内,，,以生理盐水洗三次,，,以,1500prm,离心沉淀,5,分钟。,3.,离心沉淀后加入冷,枸橼,酸缓冲液,5ml,，,在室温下放置,20,分钟。,4.,用,300,目筛网过滤后,，,以,PBS,洗,去,枸橼,酸缓冲液,，,离心沉淀去上清,，,加入,70%,乙醇固定备检。, 内镜,刷检,样品单细胞悬液制备,1.,将刷检的毛刷放入,10ml,盐水中洗脱,，,收集悬液进入试管,以,1500prm,离心沉淀,，,再以生理盐水漂洗,2-3,次,，,每次,500-800prm,离心沉淀,2,分钟,，,弃上清。,2.,以,300,目筛网过滤,，,去除细胞,团,块。,3.70%,冷乙醇固定,，,置于冰箱备检。,冲洗,液,样品单细胞悬液制备,1.,用,300-500ml,生理盐水冲洗胃或膀,胱，,冲洗一定时间后,，,吸出冲洗液放入容器中,，,于冰箱内置,6-12,小时。,2.,取沉淀,20-40ml,，,离心沉淀,，,并以生理盐水洗两次,，,