大肠杆菌DNA聚合酶1的作用与应用资料

Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,大肠杆菌DNA聚合酶 I,生物0822 0814151008 肖乐,大肠杆菌DNA聚合酶 I的活性,5-3DNA聚合酶活性,1,5-3外切核酸酶活性,2,3-5外切核酸酶活性,3,5-3DNA聚合酶活性,在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol使DNA链沿5 3方向延伸。,3 Mg,2+,dNTP 5,5 3,DNA聚合酶I,5-3外切核酸酶活性,从53方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53,。,3 Mg,2+,5,5 3,DNA聚合酶I,3-5外切核酸酶活性,由3端水解DNA链,，反应底物是带3-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3-OH端降解ds-DNA，可被5 3聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP抑制,5,Mg,2+,Mg,2+,dNTP,3,3 5,DNA聚合酶I DNA聚合酶I,活性能发生的反应,切口平移,置换反应,活性,置换反应,如果只有一种dNTP存在，3 5外切核酸活性将从3-OH端降解DNA，而5 3聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。,3 5外切酶活性,5 3,5 3聚合酶活性,切口平移,首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5-3外切核酸酶活性是切口沿5-3方向移动，同时5-3DNA聚合酶活性又不断合成DNA。,5,Mg2+DNaseI,3,5,dNTP 大肠杆菌DNA聚合酶I,3,应用,1,3-端的末端标记,2,切口平移法标记DNA,3,合成cDNA的第二链,3-端的末端标记,先用此酶的35核酸外切酶活性，切除凸出的3-粘端，形成5-凸出粘端；在以其53聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3-末端的带标记的DNA。,切口平移法标记DNA,在Dnase的作用的基础上产生连内切口，应用此酶的53聚合酶活性和53外切酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5-端向3-端移动。若用聚合反应的原料dNTP带有放射性核素-32P，就能使生成的双链带有标记物。,根据此原理可做DNA杂交探针。,合成cDNA的第二链,单链cDNA3-端可形成发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥53聚合酶活性，合成cDNA的第二链。,由于其具有5-3外切核酸酶活性，现在已不再用于此应用。,Thank You!,