药品微生物限度检查法

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,药品微生物限度检查法,吉林省食品药品检验所,长春,11/28/2024,1,微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受微生物污染程度的方法，也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。检查项目包括染菌量及控制菌检查。,11/28/2024,2,微生物限度检查法起草的指导思想,较完善检查法：,也是目前国际上常用的一种方法。是以琼脂平板上的细菌、霉菌或酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌、霉菌和酵母菌的菌落数。,增加试验的可操作性,使方法更具科学性，保证检验结果的准确性。,11/28/2024,3,检验全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净度10000级和局部洁净度100级单向流空气区域内进行，以防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按中华人民共和国国家标准GB/T 1629216294-1996 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法进行洁净度验证。,操作环境,11/28/2024,4,洁净级别,洁净级别,尘粒数/m,3,浮游菌个/m,2,沉降菌个/0.5h,微粒直径,0.5um,微粒直径,5um,100,3,500,0,5,1,10000,350,000,2000,100,3,100000,3,500,000,20,000,500,10,11/28/2024,5,检验量,检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或 cm,2,）,一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。,除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为50cm,2,贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。,要求检查沙门菌的供试品其检验量应增加10g或10ml,11/28/2024,6,供试液的制备,根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液,制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培,养基，不得超过1小时。,除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：,11/28/2024,7,（1）液体供试品 取供试品10ml,加稀释剂至100ml中混匀，作为1:10 供试液。水溶性液体制剂可用混合的供试品原液直接作为供试液。,（2）固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g加稀释剂至100ml中，用匀浆仪或其它适宜的方法，混匀后，作为1:10供试液。,供试液的制备,11/28/2024,8,非水溶性供试品,取供试品5g(5ml)，加入司盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g的无菌溶化混合物（温度低于45）的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的稀释剂至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。,特殊供试液制备方法,11/28/2024,9,特殊供试液制备方法,取供试品10g，加至含玻璃珠和20ml的无菌十四烷酸异丙酯的容器中，充分振摇，使供试品溶解，再加入约45的稀释剂，振摇5-10分钟，萃取，待油水明显分层，取其水层作为1:10供试液。,十四烷酸异丙酯的灭菌方法：采用薄膜过滤法除菌，选用孔径为0.22um的脂溶性滤膜，在140干热灭菌2小时。,11/28/2024,10,特殊供试液制备方法,非水溶性膜剂供试品 取50cm,2,剪碎，加适量的稀释剂（通常为每1ml或每2ml含1cm,2,）,浸泡，振摇，以供试品浸液作为1:10或1:20供试品。,11/28/2024,11,特殊供试液制备方法,肠溶及结肠溶制剂供试品,取供试品10g，加至100ml pH6.8磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）中或pH7.6磷酸盐缓冲液（结肠制剂），置45水浴中，振摇，使溶解，作为1:10的供试液。,11/28/2024,12,特殊供试液制备方法,具抑菌活性的供试品,当供试品有抑菌活性时，应消除其抑菌活性后，再依法检查。,常用的方法有：培养基稀释法离心沉淀集菌法 3000转/分离心20分钟，500转/分离心5分薄膜过滤法中和法,11/28/2024,13,菌数报告规则,细菌数酵母菌,平均菌落数在30-300，,霉菌,平均菌落数在30-100 之间的稀释级作为菌数报告的依据。,当仅有个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。,11/28/2024,14,菌数报告规则,当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。,11/28/2024,15,菌数报告规则,当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。,各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,11/28/2024,16,菌数报告规则,各,各稀释级菌落平均数,比值,菌落数,报告,1：10 1：,10,2,1：,10,3,不可计,不可计,不可计,39,24,0.5,164,295,271,41,19,0,20,46,60,4,1.6,2.2,10.2,16400,37750,27100,异常,240,5,16000,38000,27000,240,10,11/28/2024,17,操作要点,一个细菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成，因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity,cfu）,供试品检验的全过程必须符合无菌技术要求。,培养基、稀释剂、实验器具等的灭菌，按灭菌法（见附录）的要求采用验证合格的灭菌程序灭菌。,11/28/2024,18,操作要点,作供试品稀释时，每一稀释级都要更换吸管。,细菌培养48h，真菌培养72h，计数。如菌落极小，不易辨认可适当延长培养时间。再点计菌落数。,含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵菌数，并且合并计数。,若同一稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。,使用灭菌吸管时，管尖不要接触可能污染的任何容器或用具。,供试液稀释及注皿时应振摇后取均匀的供试液，以免造成实验误差。,11/28/2024,19,操作要点,培养基的分装量不得超过容器的2/3以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。,培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。,灭菌后的培养基应保存在2-25 防止被污染，可在三周内用毕。,已溶化的培养基应一次用完，一般开启后不宜再用，更不要反复加热溶化,注皿时培养基应在451，高于45时易造成细菌受损或致死，低于45时易凝固，影响混匀，因此使用前可用水浴保温效果较好。,倾注培养基于平皿中与样品摇匀时，切勿溅到皿盖边和皿盖上，以免影响实验结果。,11/28/2024,20,操作要点,采用薄膜过滤法时，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为,100ml,，冲洗液、冲洗量及冲洗方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。,11/28/2024,21,操作要点,每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤或加至适量稀释剂中混匀，过滤，用适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法及冲洗量同“计数方法的验证”，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜，滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。,11/28/2024,22,操作要点,菌落数在100以内时按实有数据报告。菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。,11/28/2024,23,异常情况处理,菌落蔓延：培养中由于一些菌落蔓延生长而影响另一些菌落生长，甚至掩盖了另一些菌落，干扰计数。,原因：有动力和培养环境湿度过大造成，给动力菌造成泳动的条件，促使形成蔓延菌落机会增多。,11/28/2024,24,加TTC：于倾注培养基前，在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml混匀后倾注平皿。,开盖干燥：将已凝固的琼脂平板开盖，倒置斜放于净化工作台上，开机1-2h后合盖，再放培养箱中,防止方法,11/28/2024,25,防止方法,换陶瓦盖：将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。,11/28/2024,26,异常菌数报告,在特殊情况下，营养琼脂培养基上生长的霉菌、酵母菌多于玫瑰红钠琼脂培养基上菌落数则以营养琼脂平板的霉菌、酵母菌菌落数报告，反之如玫瑰红钠琼脂平板生长了细菌，且多于营养琼脂平板的菌落数，则以玫瑰红钠琼脂平板的细菌数报告,11/28/2024,27,控制菌的检查,大肠埃希菌检验程序,供试品 供试液 ,不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液,35371824h,取 0.2ml ,5mlMUG培养基中 35375、24h,366nm紫外光下观察,加靛基质试剂,MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性,MUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性,取胆盐乳糖培养液划线,报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,3611824h 阳性,阴性,镜检、适宜的生化试验 报告,11/28/2024,28,大肠埃希菌检验程序,供试品 供试液 ,不少于100ml的 胆盐乳糖增菌液,35371824h,取 0.2ml ,5mlMUG培养基中 35375、24h,366nm紫外光下观察,加靛基质试剂,MUG阳性，靛基质 阳性 MUG阴性，靛基质 阳性,MUG阴性，靛基质 阴性 MUG阳性，靛基质 阴性,取胆盐乳糖培养液划线,报告 曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,3611824h 阳性,阴性,镜检、适宜的生化试验 报告,报告,11/28/2024,29,注意事项,配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4否则pH值偏高，MUG分解本身则显荧光。,供试品培养液接种于MUG培养基中，培养时间一般在4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养时间至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。,11/28/2024,30,注意事项,观察供试品MUG管时，可与阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察。,在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上生长的可疑菌落，务必挑选2-3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别。,在IMViC试验中，以灭菌接种环沾取菌苔，首先接种于枸椽酸盐琼脂斜面上，然后再接种于蛋白胨水等其它培养基上，切务将培养基带入枸椽酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。,11/28/2024,31,大肠菌群,大肠菌群作为水质粪便污染的指示菌已有80多年历史。大肠菌群的定义：是指37生长时能发酵乳糖，在24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌，符合上述定义的细菌除大肠埃希氏杆菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸椽酸菌属、克雷伯菌属等，实际上基本包括人和了正常家畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便