第5章_分子发光分析法_

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,9,章 荧光光度法,Fluorescence Spectroscopy,一、分子荧光分析法的基本原理,荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质浓度的关系,二、荧光分析仪器,三、荧光定量分析方法,四、荧光分析法的应用,第,7,章 分子发光分析,Molecular Luminescence Analysis,1,荧光,Fluorescence,2,磷光,Phosphorescence,3,化学发光,Chemiluminescence,关键词：激发光谱，荧光光谱，量子产率；,荧光光谱的产生、主要影响因素、荧光强度与被测物质浓度的关系；,荧光分析仪器；定量分析方法,7-1,概述,一、分子发光分析法及其分类,某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法,较高激发态,基 态,吸收能量受激,光辐射退激,分子在退激过程中以光辐射形式释放能量,根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：,光致发光：以,光源,来激发而发光,电致发光：以,电能,来激发而发光,生物发光：以,生物体释放的能量,激发而发光,化学发光：以,化学反应能,激发而发光,荧光,荧光分析法,磷光,磷光分析法,二、分子荧光分析法的特点,1.,灵敏度高,荧光强度随激发光强度增强而增强,灵敏度荧光分析法比分光光度法高,23,个数量级,2.,选择性好,选择不同的激发光波长,选择不同的检测荧光波长,3.,实验方法简单,4.,待测样品用量少,；仪器价格适中；测定范围较广,7-2,荧光和磷光光谱法,一、荧光和磷光光谱的产生,具有不饱和基团的基态分子光照后，,价电子跃迁,产生荧光和磷光,基态分子 价电子跃迁到激发态,光照激发,*,*,n,基 态,在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（,、,n,电子）处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述,S,T,T,1,S,0,ISC,VR,VR,IC,吸光 吸光,荧光,磷光,图,5-1,分子荧光、磷光光谱产生过程示意图,S,0,S,1,S,2,VR,：,振动驰豫,IC,：,内部转换,ISC,：,系间窜跃,VR,二、荧光、磷光与分子结构的关系,了解荧光与分子结构的关系，可以预测哪些物质能产生荧光，在什么条件下产生，以及发射的荧光有什么特征以便更好地运用荧光分析技术，采取一些措施把不发荧光的物质产生荧光，即把非荧光体变成荧光体，弱荧光体变成强荧光体,（一）荧光效率,荧光强度常用荧光量子效率,f,来描述,荧光量子效率,f,=,发荧光的分子数,激发态分子总数,f,是一个物质荧光特性的重要参数，反映了荧光物质发射荧光的能力，,f,越大，荧光越强，在,01,之间,（二）荧光磷光与有机化合物结构的关系,物质只有吸收了紫外可见光，发生,*,n *,跃迁，产生荧光,*与,n *,跃迁相比，摩尔吸收系数大,10,2,10,3,，寿命短,*跃迁常产生较强的荧光，,n *,跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光,1.,共轭体系,有较强的荧光,具有共轭体系的芳环或杂环化合物，,电子共轭程度越大，越易产生荧光,;,环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强,f,ex,/nm,em,/nm,0.11 205 278,0.29 286 310,0.46 365 400,苯,萘,蒽,350,菲,线,状环结构比非线状结构的荧光波长长,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光,多,环,芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定,3,，,4-,苯并,芘是强致癌物,ex,=386 nm,em,=430 nm,2.,刚性平面结构,较稳定的平面结构,具有强荧光的分子多数有刚性平面结构,荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质,酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，为非荧光物质,例,1,，,2-,二苯乙烯,反式：平面构型,强荧光体,顺式：非平面构型,非荧光体,（三）金属螯合物的荧光,大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光；不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与,M,n,+,形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光,例：,8-,羟基喹啉为弱荧光体，与,M,n,+,Al,3+,、,Mg,2+,形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加强,（四）取代基的类型,（,1,）增强荧光的取代基,有,-OH,、,-OR,、,-NH,2,、,-NHR,、,-NR,2,等给电子基团,由于基团的,n,电子（孤对电子）的电子云与苯环上的,轨道平行，共享了共轭 电子，扩大了共轭体系，使荧光波长红移，荧光强度增强,（,2,）,减弱荧光的取代基,-COOH,、,-NO,2,、,-COOR,、,-NO,、,-SH,吸电子基团,使荧光波长短移，荧光强度减弱,芳环上被,F,、,Cl,、,Br,、,I,取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。,（,3,）影响不明显的取代基,-NH,3,+,、,-R,、,-SO,3,H,等,三、环境对荧光、磷光的影响,1.,溶剂的影响,同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质,一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光强度增大,2.,温度的影响,低温下测定，提高灵敏度,3.pH,的影响,大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液,pH,的影响很大,共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具有各自的荧光效率和荧光波长,例：苯酚,离子化后，荧光消失,pH1,有荧光,pH13,无荧光,四、荧光强度与荧光物质浓度的关系,当,A0.05,时，方括号中其它各项与第一项相比可忽略不计，上式简化,If=2.3,f I0A,=2.3,f I0,bc,当,A0.05,时，,I,f,与,f,、,I,0,、,和,c,有关，对一给定物质，当激发光波长和强度一定时，,f,、,I,0,、,和,b,为常数，合并为,K,I,f,=KC,I,p,=KC,定量分析依据,（一）荧光分析仪器,主要由光源、单色器、液槽、检测器和读数器组成,光源,第一单色器,液池,检测器,第二单色器,检测器,放大器及记录器,ex,em,与,分光光度计有两点不同,两个单色器,检测器与激发光互成直角,I,0,I,五、荧光和磷光分析仪器,1,、光源,激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽,荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯,利用汞蒸气放电发光的,光源；常用其发射,365 nm,、,405 nm,、,436 nm,三条谱线,以,365 nm,的谱线最强,应用最广泛的一种光,源，可发射,250800nm,很强的连续光源,2,、单色器,第一单色器作用,：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长,ex,，,用此激发光激发液池内的荧光物质,ex,第二单色器作用,：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长,em,。在,选定的,em,下,测定荧光强度，定量分析,3,、样品池,石英材料，四面透光,4,、检测器,把光信号转化成电信号,放大,直接转成荧光强度；荧光光度计采用光电倍增管,5,、读数记录系统,记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱,（二）激发光谱和荧光光谱,荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定,激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱,I,ex,固定,em,荧光波长,获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的,em,不变，改变第一单色器波长，从,200700 nm,扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以,I,为纵坐标，,ex,为,横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱,从图中看出,磷,荧,激,图,吸收峰,荧光峰,磷光峰,六、,荧光、磷光分析及应用,（一）定量分析方法,定量分析依据,I,f,=KC,I,p,=KC,1.,标准曲线法,最常用的定量分析方法,2.,比较法,比较简单,如果试样数量不多，可用比较法进行测量,未知液,I,f,x,=,KCx,标准液,I,f,s,=,KCs,（二）荧光分析法的应用,1.,无机化合物的分析,2.,有机化合物的分析,芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃,荧光分析法是最主要的测定方法,例：,3,，,4,苯并芘,3,，,4,苯并芘为强致癌物质,煤炭、石油、天然气等燃料不完全燃烧以及吸烟、焚烧垃圾都会产生,3,，,4,苯并芘，汽车尾气也是主要来源,食品加工过程也会产生,3,，,4,苯并芘，尤其是烟熏、油炸、烘烤食品,7.3.1,概述,化学反应产生激发态分子,光发射。,用于痕量元素、环境检测、生物医学分析。,与荧光法互补。,7.3,化学发光,Chemiluminescence,特点：,灵敏度高。,鲁米诺体系测定,Cr,3+,等检测限,10,-9,g/L,线性范围宽：,5,6,个数量级,设备简单,：无光源，无需单色器，测发光总量,快速,12:24:01,7.3.2,原理,某种,反应产物接受反应能而激发，辐射放能,A+B,C*,+D,C*,C +,h,快速,释放足够能量,(,Redox,具有过氧化物中间产物的氧化反应,),激发态分子能辐射跃迁,发光效率与强度,生物发光效率高，非生物发光常,0.01,，,根据确定时间内的发光总强度定量分析,鲁米诺体系许多金属离子有催化,12:24:01,7.3.2,原理,液相示例,鲁米诺,(3-,氨基苯二甲酰肼,),体系,12:24:01,max,=425nm,可检测,10,-9,mol/L,的,H,2,O,2,过渡金属催化此反应,发光大大增强。,测,Co(II)/Cu(II)/Ni(II,),等,0.01,40,g/ml,7.3.2,原理,气相示例,氮氧化合物化学发光,波长范围,600,875,nm,检测限,1,ng,/ml,。可用于测,NO,或,O,3,可间接测定,NO,2,(,还原为,NO),和,NH,3,(,高温氧化为,NO,2,),测量汽车尾气中,NO,x,12:24:01,