氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第7章 氨基酸、多肽、蛋白质和酶类药品检验,氨基酸类药物含量测定常用的方法,1.酸碱滴定法,示例1：谷氨酸的含量测定,示例2：赖氨酸片中赖氨酸的测定,2.非水溶液滴定法,示例：酪氨酸的含量测定,3.定氮法,示例：天门酰氨片的含量测定,赖氨酸片中赖氨酸的测定中,1)为什么要用NaOH调节pH为7.0？,2）加入甲醛溶液的作用？,3）是直接滴定还是其他的滴定方式？,非水溶液滴定法,非水溶液滴定法是在非水溶剂中进行滴定的方法。主要用来测定有机碱及其氢卤酸盐、磷酸盐、硫酸盐或有机酸盐，以及有机酸碱金属盐类药物的含量。也用于测定某些有机弱酸的含量。,非水溶剂的种类(1) 酸性溶剂有机弱碱在酸性溶剂中可显著地增强其相对碱度，最常用的酸性溶剂为冰醋酸。(2) 碱性溶剂有机弱酸在碱性溶剂中可显著地增强其相对酸度，最常用的碱性溶剂为二甲基甲酰胺。,定氮法,样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。,4.碘量法或溴量法,示例一：盐酸半胱氨酸水合物的测定,示例一：L-胱氨酸的测定,5.HPLC法,示例一：三氨基酸注射液-341,示例二：六氨基酸注射液400,6.氨基酸自动分析仪,碘量法,原理：半胱氨酸分子中含有SH， 在酸性条件下，与过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠溶液滴定。由硫代硫酸钠溶液所消耗的量，间接求出硫化物的含量。,注意：滴定条件，指示剂，碘滴定液，Na,2,S,2,O,3,标液配制,碘量法的背景知识,(一) 方法简介,碘量法也是常用的氧化还原滴定方法之一。它是以I,2,的氧化性和I,-,的还原性为基础的滴定分析法。因此，碘量法的基本反应是,由,E,可知,I,2,是一种较弱的氧化剂，能与较强的还原剂作用；而,I,-,是一种中等强度的还原剂，能与许多氧化剂作用，因此碘量法又可以用直接的和间接的两种方式进行滴定。,1,、碘滴定法,(,也称直接碘量法,),电位比,E,I,2,/I,低的还原性物质，可以直接用,I,2,的标准溶液滴定的并不多，只限于较强的还原剂，如：,S,2-,、,SO,3,2-,、,Sn,2+,、,S,2,O,3,2-,、,AsO,3,2-,、,SbO,3,3-,等。,剩余碘量法,在供试品中先加入一定量、过量的碘滴定液，待I,2,与测定组分反应完全后，再用硫代硫酸钠滴定液滴定剩余的碘，根据与药物作用的碘的量来计算药物含量的方法。,2、滴定碘法(间接碘量法),电位比,E,I2/I,高的氧化性物质，可在一定的条件下，用碘离子来还原，产生相当量的碘，然后用Na,2,S,2,O,3,标准溶液来滴定析出的I,2,，这种方法叫做间接碘量法或称为滴定碘法。例如K,2,Cr,2,O,7,在酸性镕液中与过量的KI作用，析出的I,2,用Na,2,S,2,O,3,标准溶液滴定。,Cr,2,O,7,2-,+6I,-,+14H,+,2Cr,3+,+3I,2,+7H,2,O,I,2,+2S,2,O,3,2,2I,-,+S,4,O,6,2,利用这一方法可以测定很多氧化性物质,如ClO,3,-,、ClO,-,、CrO,4,2-,、IO,3,-,、BrO,3,-,、SbO,4,3-,、MnO,4,-,、MnO,2,、AsO,4,3-,、,NO,3,-,、,NO,2,-,、Cu,2+,、H,2,O,2,等等，以及能与CrO,4,2-,生成沉淀的阳离子，如Pb,2+,、Ba,2+,等，所以滴定碘法的应用范围相当广泛。,碘量法常用,淀粉作指示剂,，淀粉与碘作用形成蓝色络合物，灵敏度很高，即使在510,6,mol/L溶液中亦能看出。,淀粉指示剂应在近终点时加入，因为当溶液中有大量碘存在时，碘可被吸附在淀粉表面，影响终点的正确判断。,碘滴定液(0.1mol/L),I,2,=253.81 12.69g1000ml,【配制】 取碘13.0g,加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。,碘量法的主要误差来源,，一是I,2,易挥发，二是I,-,易被空气中的氧所氧化。,为防止I,2,挥发，应采取以下措施：,1. 加入过量KI，KI与I,2,形成I,3,，以增大I,2,的溶解度，降低I,2,的挥发性，提高淀粉指示剂的灵敏度。,此外，加入过量的KI，可以加快反应的速度和提高反应的完全程度。,2.反应时溶液的温度不能高，一般在室温下进行。因升高温度增大I,2,的挥发性，降低淀粉指示剂的灵敏度。保存Na,2,S,2,O,3,溶液时，室温升高，加速Na,2,S,2,O,3,的分解。,3.析出碘的反应最好在带塞的碘量瓶中进行，滴定切勿剧烈摇动。,为防止I,-,被空气中的氧所氧化，,应采取以下措施,：,1.避光 光线能催化I,被空气氧化。,2.溶液pH值的影响 S,2,O,3,2,与I,2,之间的反应必须在中性或弱酸性溶液中进行。因为在碱性溶液中，I,2,与S,2,O,3,2,将会发生下述副反应：,S,2,O,3,2,+4I,2,+10 OH,2SO,4,2,+8I,十5H,2,O,而且，I,2,在碱性溶液中还会发生歧化反应：,3 I,2,+6OH,IO,3,+5I,+3H,2,O,如果在强酸性溶液中，Na,2,S,2,O,3,溶液会发生分解： S,2,O,3,2,+2H,+,SO,2,+S+ H,2,O,同时，I,在酸性溶液中也容易被空气中的O,2,氧化：,4I,+4H,+,+O,2,=2I,2,+2H,2,O,3.在间接碘量法中，当析出碘的反应完成后，应立即用Na,2,S,2,O,3,进行滴定(避免I,2,的挥发和I,被空气氧化)。,（二）应用实例,1.铜矿石中铜的测定,矿石经HCl、HNO,3,、溴水和尿素处理成溶液后、用NH,4,HF,2,掩蔽试样中的Fe,3+,，使其形成稳定的FeF,6,3-,络合物，并调节溶液的pH为3.54.0，加入KI与Cu,2+,反应，析出的I,2,，用Na,2,S,2,O,3,标准溶液滴定，以淀粉为指示剂，反应式如下：,2Cu,2+,+4I,2CuI+I,2,I,2,十2S,2,O,3,2,2I,+S,4,O,6,2,本法可测定矿石中0.5%以上的铜。,2.钡盐中钡的测定,在HAc-NaAc缓冲溶液中，CrO,4,2,能将Ba,2+,沉淀为BaCrO,4,。沉淀经过滤、洗涤后，用稀HCl溶解，加入过量KI，Cr,2,O,7,2,将I,氧化为I,2,，析出的I,2,，以淀粉为指示剂用Na,2,S,2,O,3,标准溶液滴定。反应式如下：,Ba,2+,+ CrO,4,2,BaCrO,4,(黄),2BaCrO,4,+4H,+,2 Ba,2+,+H,2,Cr,2,O,7,+H,2,O,Cr,2,O,7,2,+6I,+14H,+,3I,2,+2Cr,3+,+7H,2,O,I,2,+2S,2,O,3,2,2I,+S,4,O,6,2,HPLC（高效液相色谱）,柱的类型： 检测器类型：,固定相： 流动相：,氨基酸自动分析仪,一种专门用来分析氨基酸的自动化的液相色谱仪。,原理：蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。,一份水解液可同时测定天冬，苏，丝，精氨酸等16种氨基酸。,多肽类药品检测,1.酸碱滴定法,2.紫外分光光度法,3.效价测定法（略）,示例一：抑肽酶效价的测定,示例二：杆菌肽效价的测定,蛋白质类药品的检验,定氮法,电泳法（重点介绍）,生物检定法,电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。,醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm0.15mm为宜。,特点：操作简单、灵敏度高，样品用量少。电泳时间短，一般电泳4560min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。,醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白,效价单位U,效价:指某一物质引起生物反应的功效单位,可用理化方法检测,也可用生物检测方法测定，通常以重量单位或效价单位来计量。不同的药物有各自的效价的定义。,某些生化药物，其药物中含有一些杂质，不可能是纯品。故不能以重量单位准确表示其含量，只能依靠生物检定的方法与标准品进行比较来测定药物的效价剂量。因此，采用特定的“单位”“U”来计量。产生相同效应药品的剂量比较时，所需剂量越小，药物的效价就越高，反之效价就低。,临床上常见到的以效价单位计量的药物有生物制剂如蛋白质类、酶制剂、激素、维生素及部分抗生素类药。这些药物依中国药典规定，均以其特有的药理效价表示剂量。,肝素的效价是以每毫克肝素制剂(602mmHg柱真空干燥3小时)所相当的单位数来表示。1U为24h内在冷处阻止1ml猫血凝结所需的最低肝素量。在制药工业的发展过程中，随着制药工艺的提高，药物的纯度也逐年提高，其生物效价亦随之愈来愈高。该药研制初期的生物效价，每1.0mg效价相当于125U,1977版中国药典规定肝素钠每1.0mg效价不得少于140U，而1995版药典则定为每1.0mg效价不得少于150U，2005年为不少于156U，2010年版改为不得少于170U。,酶类药品检验,-,酶活力测定法,酶活力概念,酶活力 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。,但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。,所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,一. 酶活力的测定：,（一）酶活力测定的基本知识：,酶不易制成纯品，其中含有很多杂质，真正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。,酶活力,是通过测定酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即测定,酶促反应的速率,来获得的。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，这是由于反应体系中使用的底物往往是过量的，而反应时间通常又很短，尤其是在酶活力很低时，底物减少量仅占加入量的很小比例，因此测定不易准确；反之，产物从无到有(如不纯的酶制剂中内源性产物不计的话)，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故酶活力测定绝大多数是采用测定,产物生成速率,的方法。,测定酶活力时通常都附有适当的,对照,(control )以消除非酶促反应所生成的产物，常用的对照有以下几种，可根据具体情况予以选择。,1.,样品对照,若测定酶活力的样品是粗提取液，属于非常不纯的酶制剂，往往含有所欲测定的产物，也可能在保温时由于内源性底物的旁反应产生相同的产物，这些可通过不加底物单加样品的样品对照予以消除。,2.,底物对照,某些酶的底物能自发(非酶促)地分解成所欲测定的产物，可以通过不加样品单加底物的底物对照予以消除。,3.,时间对照,若酶制剂不纯(含有产物)和底物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。,在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以根据预实验决定。,测定管中的产物量必须减去对照管中的产物才是真正由酶促反应所生成的产物量。,（二）酶活力测定的方法：,酶活力测定要符合两个原则：,在零级反应期测定，即-s或p与反应时间t成正比，,反应速度与酶量成线性关系，即,E= k(-s/ t) = kp/ t,常用的方法有：,1.定时法,2.连续检测法,3.平衡法,如何测定酶活力？,以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线,0,产物浓度,时间,注意：初速度的测定是关键。,可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降,产物浓度,时间,0,原 因,底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快,产物的抑制作用,酶本身逐渐失活,1.定时法:,测定酶反应开始后某一时间内(t,1,到t,2,)产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法。因t,1,和t,2,是整个反应历程的两个点，故又称,两点法,，其中t,1,一般 取反应开始的时间，在酶反应进行一定时间(t,2,)后终止反应，如加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等，然后测定底物或产物的变化。,这种方法的,优点是简单,，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。,因此，用定时法测定酶活力时，应先,做预试验来确定线性时间,，并在线性时间内进行测定，否则，不能用p除以t来表示每分钟产生的p，并用其计算酶活力单位。,2.连续监测法:,连续测定(每15s-1min监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法，又称动力学法或速率法。定时法只测定两个时间 点，而连续监测法则进行,多点连续测定,。,这种方法的,优点,是可将多点的测定结果(s或p的变化)连接成线，,容易找到成直线的区段,，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。也可在反应曲线的拐点处求出其切线的斜率，即初速度。连续监测法测定的结果通常较定时法高，也较为准确，因为前者测定时间较短，而在酶反应的初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶的变性作用等均很小。,用连续监测法测定的,缺点,是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器(比色计或分光光度计)必须有保温装置，而且产物(或底物)应是可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物(或产物)有明显差别，否则，需加入其它试剂(如显色剂、酶试剂等)，将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。,3.平衡法:,通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法，或称,终点法,。因定时法是在酶反应的动态期进行测定，故需终止反应后才能测定，而平衡法则无需，因在平衡期中任何一点进行测定，底物和产物的量都不再变化。,用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把p或s 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆 反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监 测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于,有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定,。,(三) 酶活力的表示方法:,酶活力的大小是以酶单位数表示的。所谓酶单位是在某一特定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，而速度即指单位时间(秒、分、小时)内反应物的变化量(毫克、微克、微 摩尔、摩尔等)。酶单位一般有三种表示方法。,1.惯用单位 :,60年代前，各种酶活力的表示法或酶单位的定义没有统一的标准，不同酶、 甚至同一种酶不同的测定法可有不同的定义。,这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。,酶习惯上或测定时使用的,反应速度的单位,定义为酶的活力单位。有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化 (,D,A/t) 表示酶活力单位。,2. 国际单位 :,1961年国际生化学会(IUB)酶学委员会建议使用统一的国际单位(IU)。规定一 个国际单位(IU)为在实验规定的条件下(如温度为25、最适pH、最适底物浓度时)，,每分钟催化一个微摩尔底物变化所需要的酶量。,酶的浓度可以IU/L或IU/mL来表示；当底物为蛋白质、多糖等含有多个能被酶作用的键或基团时，可用催化一个微摩尔被作用的基团或键的变化来表示酶单位。如采用物理方法测定，应该在物理量与化学量之间建立对应关系进行换算 。,国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。但也有不少缺点，如 ：从惯用单位换算成国际单位比较麻烦；某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微摩尔数； 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时，其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的不同，常采用不同的测定温度，如25、30、37等，这也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不同的。,3.katal单位,1972年酶学委员会又提出一种新的酶单位katal(简称kat)，即在确定的最适反应条件下每秒钟催化一摩尔底物变化所需要的酶量为1kat单位。,1kat = 6010,6,IU 1nkat = 0.06IU 1IU = 16.67nkat,指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯,比活力 ,酶活力单位数（U）,酶蛋白质量（mg）,酶的比活力,酶的纯度,纯化倍数,=,每次比活力,/,第一次比活力,产率(回收率),=,每次总活力,/,第一次总活力,100%,示例：从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？,酶活力测定的方法,有两种主要方法即终止反应法和连续反应法。,终止反应法,：是在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。,连续反应法：无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。,酶活力测定的步骤,配制底物、对照品溶液、供试品酶溶液等 。,确定酶催化反应的温度、pH、浓度、辅助因子等反应条件。,进行酶促反应，准确记录反应时间。,终点法（终止反应）、连续法测定产物的增量。,常见的测定方法有分光光度法、荧光法、化学反应法等。,计算酶活力。,学习,Folin,-,酚法测定蛋白酶活力的原理方法,掌握分光光度计的操作方法,【目的要求】,实验 枯草芽孢杆菌,蛋白酶活力的测定,【重点掌握】,蛋白酶浸提、分离、提取技术,最适条件下酶促水解反应的操作程序,酶活力的测定及活力单位的计算,【重点掌握】,测定酶活的程序,1、将酶液稀释到一定程度,2、最适条件,下,进行酶促水解反应,3、测定反应量,4、根据酶活单位定义计算酶活力,【重点掌握】,1、将酶液稀释到一定程度,在,底物浓度一定，反应时间一定内维持初速度，必须调整酶的最适稀释倍数即,吸光度限制在0.250.40范围内。,【重点掌握】,2、最适条件,下,进行酶促水解反应,最适温度, 37,恒温水浴,最适,pH,值, pH7.5,缓冲溶液,底物浓度足够大, 1%,酪蛋白溶液,1mL,反应时间准确, 10min,及时灭活,三氯乙酸,2mL,【重点掌握】,3、测定反应量,测定产物的增加量或底物的减少量, 测定酪氨酸的生成量,4、根据酶活单位定义计算酶活力,酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。,酪蛋白,蛋白酶,酪氨酸,比色测定,钼蓝,钨蓝,酪氨酸,Folin-酚试剂,【实验原理】,pH值、温度,OH,-,1）,用一系列浓度不同的酪氨酸标准液与,Folin-酚试剂作用，产生兰色深浅不同的溶液,，680nm波长处，作出,酪氨酸浓度-,吸光度标准曲线。,2）,用,酶促水解液进行同样操作,，比色后，查阅标准曲线，即可求得待测酶活力。,操作程序,1、取6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；,2、混匀器充分,混匀后，,置37恒温水浴反应20min；,3、以0,#,管做参比，分别比色测定各管A,680,；,4、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当,吸光度为1时的酪氨酸的量（g）即为K值。,【实验器材】,一、,标准曲线的绘制,1、取6支干燥试管，编号，按教材表格顺序加入试剂；,2、混匀器充分,混匀后，,置37恒温水浴反应20min；,3、以0,#,管做参比，分别比色测定各管A,680,；,4、绘制标准曲线，根据作图或用回归方程，计算出当,吸光度为1时的酪氨酸的量（g）即为K值。,【,操作方法,】,【,操作方法,】,二、待测酶液的制备,称取酶粉0.500g，用少量,pH7.5,缓冲液溶解用缓冲液定容至50mL容量瓶中（,N =100倍,）。摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（至吸光度在0.250.40范围内，,N =1000倍,）。,【操作方法】,取3支试管，分别加入1mL,酶液，置37预热5min,空白管,平行管,2mL 三氯乙酸,37，10min,2mL 三氯乙酸,37，10min,1mL 1%酪蛋白,37，10min,1mL 1%酪蛋白,37，10min,过 滤,（1）,（2）,（3）,三、蛋白酶活力的测定,【操作方法】,【操作方法】,另取3支试管，分别,取,管滤液,1mL,（3）,各加入5mL Na,2,CO,3,溶液,1mL,Folin,酚试剂,（4）,37反应20min,（5）,（6）,比色测定A,680,，,管做参比,可见分光光度计,四、酶活力的计算,酶活单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。,蛋白酶活力（u/g或u/mL）=AK,4,N,10,式中 A,样品平行试验的平均吸光度；,K,吸光常数；,4,反应试剂的总体积（mL）；,10,反应时间10min，以1min计；,N,稀释倍数,所得结果表示至整数。,【操作方法】,酶类药品检验,-,效价测定,