第八章基因工程

单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章,基,基因,工,工程,第一节,基,基,因,因工程,概,概述,遗传工,程,程广义,：,：,细胞工,程,程、蛋,白,白质工,程,程、基,因,因工程,、,、酶工,程,程、发,酵,酵工程,狭义：,基,基因工,程,程,基因工,程,程概述,基因工,程,程是,20,世纪,70,年代初,随,随着,DNA,重组技,术,术的发,展,展应运,而,而生的,一,一门新,技,技术。,1982,年经美,国,国食品,及,及药物,管,管理局,批,批准，,采,采用基,因,因工程,方,方法在,细,细菌中,表,表达生,产,产的人,的,的胰岛,素,素进入,市,市场，,成,成为基,因,因工程,产,产品直,接,接造福,于,于人类,的,的首例,。,。,1985,年转基,因,因植物,获,获得成,功,功。,1996,年克隆,羊,羊诞生,。,。,现在，,人,人类已,利,利用这,一,一技术,改,改造和,创,创建新,的,的生命,形,形态、,生,生产药,品,品、疫,苗,苗和食,品,品，诊,断,断和治,疗,疗遗传,疾,疾病。,基因工,程,程的基,本,本步骤,：,：,1.,目的基,因,因的分,离,离或合,成,成。,2.,将目的,基,基因与,载,载体,DNA,连接，,构,构建重,组,组,DNA,分子,-,表达载,体,体。,3.,将重组,DNA,分子导,入,入受体,细,细胞，,并,并获得,具,具有,外源基,因,因的个,体,体。,4.,转基因,生,生物的,检,检测与,鉴,鉴定。,5.,转基因,生,生物的,安,安全性,评,评价,。,。,第二节,基,基,因,因的分,离,离,基因分,离,离（克,隆,隆）包,括,括,3,个步骤,：,：,1.,目标,DNA,片段（,基,基因）,的,的分离,；,；,2.,目标基,因,因克隆,到,到载体,上,上；,3.,载体导,入,入宿主,细,细胞并,在,在其中,大,大量复,制,制。,一、工,具,具酶,1,、限制,性,性内切,核,核酸酶,限制酶,：作用,于,于特定,（,（异）,核,核苷酸,序,序列的,磷,磷,酸二脂,酶,酶。,型酶：仅,Eco,B,和,Eco,K,两种，,催,催化限,制,制性切,割和修,饰,饰核苷,酸,酸,2,种功能,。,。,型酶：基因,工,工程中,应,应用最,广,广泛。,型酶：具有,特,特异的,识,识别位,点,点，识,别,别位点,是,是,非对称,的,的。,型限制,性,性酶的,基,基本特,性,性：, 有,特,特异识,别,别和切,割,割的序,列,列部位,；,；,DNA,分子上,两,两个单,链,链断裂,的,的部位,通,通常不,是,是,直接相,对,对的；, 断,裂,裂所形,成,成的,DNA,片段常,具,具有碱,基,基互补,的,的,单链尾,巴,巴（粘,性,性末端,）,）；,限制性,内,内切酶,Eco,RI,的酶切,位,位点及,酶,酶切产,物,物连接,回纹序,列,列,图,12-1,通过用,相,相同的,限,限制性,内,内切酶,切,切割,形成一,个,个重组,DNA,分子,限制性,内,内切酶,Sma,I,的识别,及,及酶切,位,位点,平齐末,端,端,2,、,DNA,连接酶,DNA,连接酶：重组,DNA,分子构,建,建必不,可,可少的,工,工具酶,，,，能催,化,化,DNA,中相邻,的,的,3OH,和,5,磷酸基,末,末端之,间,间形成,磷,磷酸二,酯,酯键并,把,把两段,DNA,连接起,来,来。,3,、反转,录,录酶,一类以,RNA,为模板,来,来指导,DNA,合成的,DNA,聚合酶,，,，故又,称,称依赖,于,于,RNA,的,DNA,聚合酶,。,。,4,、聚合,酶,酶链式,反,反应,(PCR),PCR,是体外快,速,速扩增,DNA,的方法,由美国的,Mullis(1986),发明,1993,年诺贝尔,化,化学奖。,PCR,可对特定,DNA,片段进行,扩,扩增，且,可,可用痕量,DNA,作模板，,对,对,DNA,纯度要求,也,也不高,可在几小,时,时内使目,的,的基因片,段,段扩增到,数,数百万个,拷,拷贝。,PCR,反应从启,动,动到结束,称,称为一个,循,循环，每,个,个循环包,括,括三个步,骤,骤：,1,）变性：,95,，,DNA,双链分离,成,成单链。,2,）退火,(,复性,),：,55,左右，引,物,物与单链,的,的,模板,DNA,序列互补,结,结合。,3,）延伸：,72,左右，,Taq,酶通过在,引,引物的,3-,OH,端增加碱,基,基的办法,使引物延,伸,伸。,表,12-2PCR,循环数与,PCR,产物的拷,贝,贝数之间,的,的关系,循环数,PCR,产物拷贝数,1,2,1,2,5,2,5,32,10,2,10,1024,15,2,15,32768,20,2,20,1048576,25,2,25,33554432,30,2,30,1073741824,二、载体,载体：将外源,基,基因送入,受,受体细胞,的,的工具。,载体类型：细菌质,粒,粒、噬菌,体,体或病毒,、,、细菌,/,酵母菌人,工,工染色体,BAC,、,YAC,等。,载体特点：, 在宿,主,主细胞中,能,能独立复,制,制，即本,身,身为复制,子,子,，有独立,的,的复制起,始,始位点。, 有限,制,制酶切位,点,点，允许,外,外源基因,插,插入且插,入,入,后随载体,DNA,分子一同,进,进行复制,或,或扩增。, 有选,择,择标记，,便,便于选择,含,含重组,DNA,分子的寄,主,主,细胞。, 分子,量,量小，多,拷,拷贝，易,于,于操作。, 载荷,外,外源,DNA,的大小范,围,围要宽，,安,安全。,（,1,）细菌质,粒,粒：广泛,应,应用于基,因,因工程,图,12-6,质粒,pUC18,的结构及,多,多克隆位,点,点,（,2,）,噬菌体载,体,体,1,、,噬菌体；,2,、,噬菌体,DNA,；,3,、,噬菌体,DNA,中间基因,簇,簇；,4,、将连接,物,物体外包,装,装后感染,细,细菌，制,备,备基因库（用于基,因,因库构建,）,）,（,3,）克隆大,片,片段,DNA,的载体,黏粒载体,：,：含有,cos,位点,的质粒载,体,体，兼有,噬菌体,的高效感,染,染能力和,质,质粒的易,于克隆和,选,选择的优,点,点。,克隆外源,片,片段的长,度,度在,15-,45kb,之间。,细菌人工,染,染色体（,BAC,）,上述的几,种,种载体都,不,不能携带,大,大于,50kb,的外源,DNA,片段，而,很,很多真,核生物基,因,因长度,在,50kb,以上。细,菌人工染,色,色体载,体就是为,克,克隆更,大的外源,DNA,片段,而设计构,建,建的基于,F,因子的人,工,工载体。,图,12-9,细菌人工,染,染色体载,体,体,pBAC,108L,及其多克,隆,隆位点。可插入达,300kb,左右的,DNA,片段。,酵母人工,染,染色体（,YAC,）,YAC,载体是基,于,于酵母染,色,色,体结构设,计,计的，可,以,以插入,大片段的,DNA,（,1-2Mb,），,成为人类,基,基因组计,划,划,（,HGP,）的一种,重,重要工具,。,。,三、基因,分,分离方法,一个基因,就,就是编码,一,一条多肽,链,链的一个,DNA,片段。包,括,括,：,：,启,启,动,动,子,子,、,、,终,终,止,止,子,子,、,、,内,内,含,含,子,子,等,等,。,。,1,、,基,基,于,于,文,文,库,库,的,的,基,基,因,因,分,分,离,离,方,方,法,法,基,因,因,文,文,库,库,(library),：,是,是,一,一,组,组,DNA,和,cDNA,序,列,列,克,克,隆,隆,的,的,集,集,合,合,体,体,。,。,从,从,基,基,因,因,文,文,库,库,中,中,分,分,离,离,基,基,因,因,的,的,流,流,程,程,为,为,：,：,（,1,）,构,构,建,建,基,基,因,因,文,文,库,库,基,因,因,组,组,文,文,库,库,：,：使,用,用,与,与,切,切,割,割,质,质,粒,粒,相,相,同,同,的,的,限,限,制,制,性,性,内,内,切,切,酶,酶,，,，,将,将,供,供,体,体,生,生,物,物,体,体,的,的,基,基,因,因,组,组,DNA,切成许多片,段,段，然后将,其,其连接到载,体,体上构成的,一,一个重组,DNA,群体,cDNA,文库：以,mRNA,为模板，在,反,反转录酶作,用,用下，合成,cDNA,，将其与适,当,当载体连接,并,并转化到宿,主,主细胞内进,行,行扩增构建,成,成的基因库,。,。,（,2,）筛选基因,库,库,利用一段核,苷,苷酸序列,(DNA,、,cDNA,或寡核苷酸,),作探针,(probe),，用放射性,同,同位素或非,放,放射性同位,素,素标记探针,，,，也可用抗,体,体作探针，,筛,筛选基因库,。,。,图,12-10,菌落杂交技,术,术,（,3,）阳性克隆,的,的分析与鉴,定,定,从基因库中,筛,筛选出的阳,性,性克隆，还,需,需进一步分,析,析、鉴定，,才,才能得到目,的,的基因,序列测定、,生,生物信息分,析,析、功能预,测,测、功能鉴,定,定。,2,、,T-DNA,标签克隆基,因,因,利用,T-DNA,插入,突变创造突,变,变,体，获取目,标,标,基因或克隆,。,。,T-DNA,载体构建,转化植物（,T,1,，,T-DNA,杂合子,),收获,T,2,种子,筛选,T,2,，获突变子,，,，应为,3:1,分离,确定,T-DNA,与突变型共,分,分离的个体,产生纯合后,代,代,克隆,T-DNA,两侧的植物,DNA,利用侧翼,DNA,序列作探针,从,从,cDNA,文库中钓取,基,基因,基因功能的,验,验证（遗传,互,互补测验，,分,分离的,野生基因转,化,化突变体，,回,回复功能）,图,12-11T-DNA,标签克隆基,因,因的基本原,理,理,3,、基于,PCR,的基因克隆,原理：根据待扩增,基,基因的序列,合,合成引物，,使,使两个引物,序,序列之间的,基,基因序列获,得,得大量扩增,，,，产生大量,的,的基因拷贝,用,用于研究。,4,、基因的人,工,工合成,对于已知核,苷,苷酸序列、,分,分子量较小,的,的基因可以,通,通过化学合,成,成法制备基,因,因。一般先,一,一段一段地,合,合成，然后,将,将这些小片,段,段连接起来,。,。人工合成,基,基因可以由,DNA,自动合成仪,来,来完成 。,第三节,外,外源基因的,导,导入,一、重组,DNA,技术,重组,DNA,：指利用不同,生,生物来源的,DNA,分子拼接的,杂,杂种,DNA,分子，是自,然,然界中不存,在,在的,DNA,分子。,重组,DNA,技术主要步,骤,骤：,1),从细胞或组,织,织获得,DNA,并纯化；,2),用限制酶切,割,割,DNA,；,3),将所得限制,片,片段连接到,载,载体上,形成重组,DNA,分子；,4),重组,DNA,导入宿主细,胞,胞，在宿主,细,细胞内复制,，,，,产生大量相,同,同拷贝的重,组,组,DNA,分子,-,克隆。,5),克隆的,DNA,分子可以从,宿,宿主细胞中,回,回收，纯化,；,；,6),克隆的,DNA,可以转录和,翻,翻译，其产,品,品可以被分,离出来用于,研,研究或商业,开,开发。,重组,DNA,分子,二、植物遗,传,传转化方法,1,、农杆菌介,导,导法,（,1,）根癌农杆,菌,菌,(Ti,质粒,),（,2,）发根农杆,菌,菌,(Ri,质粒,),Ti,质粒及其衍,生,生载体,Ti,质粒包括五,个,个区域：,LB,与,RB,之间的,T-DNA,，这段序列,整,整合到植物,基,基因组中；,质粒转移区,(PT),；,3.,冠瘿碱代谢,区,区；,4.,复制原点；,5.,毒性区,(Vir),。,T-DNA,区域内的所,有,有基因与转,移,移无关，所,以,以将致瘤基,因,因全部缺失,即,即卸甲,(disarmed),后，将细菌,抗,抗生素的抗,性,性基因或其,它,它序列插入,到,到这个区域,，,，形成的,T-DNA,仍可将,RB,至,LB,内的序列转,移,移并整合到,植,植物基因组,。,。,Vir,区的毒性基,因,因是,T-DNA,转移所必需,的,的，毒性基,因,因可以顺式,及,及反式两种,方,方式控制,T-DNA,转移,。,。,Ti,质粒,是,是约,150-200kb,的环,状,状,DNA,分子,，,，很,难,难直,接,接使,用,用，,故,故需,对,对其,加,加以,改,改造,，,，构,建,建出,Ti,质粒,的,的衍,生,生载,体,体系,统,统，,广,广泛,用,用作,植,植物,基,基因,工,工程,中,中的,载,载体,：,：,（,1,）双,元,元载,体,体,(binaryvectors,）,如,pBin19,载体,，,，具,有,有原,核,核生,物,物的,卡,卡那,霉,霉素,抗,抗性,基,基因,(Aph,),作为,细,细菌,选,选择,标,标记,，,，真,核,核生,物,物的,卡,卡那,霉,霉素,抗,抗性,基,基因,(nos-Npt,),作为,植,植物,的,的选,择,择标,记,记，,pUC19,的多,克,克隆,位,位点,及,及,-,互补,显,显色,标,标记,（,2,）共,整,整合,载,载体,(integratedvectors),图,12-15,棉花,转,转基,因,因植,株,株生,产,产过,程,程,F,1.,共培养,2.,在选择培养基上筛选,3.,筛选获得的抗性愈伤,5.,胚萌发成苗,6.,转基因植株移栽大田,4.,抗性,愈,愈伤,分,分化,成,成胚,状,状体,2,、基,因,因枪,法,法,基因,枪,枪法,生物,弹,弹法,微粒,枪,枪法,微粒,轰,轰击,法,法,金、,钨,钨,依赖,高,高速,的,的金,属,属微,粒,粒将,外,外源,基,基因,导,导入,活,活细,胞,胞的,一,一种,转,转化,技,技术,。,。,优点,：,：无,宿,宿主,限,限制,，,，可,以,以对,任,任何,基,基因,型,型材,料,料进,行,行转,化,化研,究,究,第四,节,节,转,转基,因,因生,物,物的,检,检测,与,与鉴,定,定,一、,分,分子,检,检测,PCR,：假,阳,阳性,与,与假,阴,阴性,Southernblot,：转,基,基,因的,完,完整,性,性和,拷,拷贝,数,数,Northernblot,：,mRNA,Westernblot,：蛋,白,白质,二、,性,性状,鉴,鉴定,M 1 2,3 4 5 6,7 8 9,第五,节,节,基,基因,工,工程,的,的应,用,用及,安,安全,性,性评,价,价,一、,基,基因,工,工程,的,的应,用,用,1,、转,基,基因,植,植物,抗除,草,草剂,、,、抗,虫,虫、,抗,抗病,、,、,抗逆,的,的优,良,良品,系,系或,品,品种,，,，,很多,已,已经,大,大面,积,积种,植,植推,广。,2008,年,1.25,亿公,顷,顷：,大豆,、,、玉,米,米、,棉,棉花,、,、,水稻,、,、马,铃,铃薯,、,、番,茄,茄等,2,、转,基,基因,动,动物,：,：羊,、,、牛,3,、基,因,因工,程,程工,业,业,生产,胰,胰岛,素,素等,在细,菌,菌中,产,产生,胰,胰岛,素,素的,方,方法,4,、遗,传,传疾,病,病诊,断,断,RFLP,法（,镰,镰刀,性,性贫,血,血病,）,）,5,、基,因,因治,疗,疗,利用,基,基因,工,工程,技,技术,，,，将,特,特异,基,基因,导,导入,并,并整,合,合到,具,具有,遗,遗传,缺,缺陷,的,的患,者,者的,基,基因,组,组中,，,，以,治,治疗,遗,遗传,疾,疾病,。,。,基因,治,治疗,的,的载,体,体和,重,重组,DNA,分子,6,、环,境,境保,护,护,生物,修,修复，指,利,利用,生,生物,吸,吸收,、,、降,解,解、,转,转化,环,环境,中,中的,污,污染,物,物，,使,使污,染,染物,的,的浓,度,度降,低,低到,可,可接,受,受的,水,水平,，,，或,将,将有,毒,毒有,害,害的,污,污染,物,物转,化,化为,无,无害,的,的物,质,质，,也,也包,括,括将,污,污染,物,物稳,定,定化,，,，以,减,减少,其,其向,周,周边,环,环境,的,的扩,散,散。,一,一般,分,分为植物,修,修复、动物,修,修复和微生,物,物修,复,复三种,类,类型,。,。根,据,据生,物,物修,复,复的,污,污染,物,物种,类,类，,它,它可,分,分为有机,污,污染,生,生物,修,修复和重金,属,属污,染,染的,生,生物,修,修复和放射,性,性物,质,质的,生,生物,修,修复等。狭义,的,的生,物,物修,复,复，是,指,指通,过,过微,生,生物,的,的作,用,用清,除,除土,壤,壤和,水,水体,中,中的,污,污染,物,物，,或,或是,使,使污,染,染物,无,无害,化,化的,过,过程,。,。,二、,安,安全,性,性评,价,价,1,、外,源,源基,因,因的,毒,毒性,；,；,2,、人体免,疫,疫系统潜,在,在过敏反,应,应问题；,3,、抗生素,抗,抗性风险,问,问题；,4,、“超级,杂,杂草”及,生,生物多样,性,性；,5,、转基因,食,食品的安,全,全性。,