分子生物学在检验医学中的应用

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学在检验医学中的应用,一、分子生物学在检验医学中的常用技术,1、,PCR技术,2、,RT-PCR技术,3、,RFLP,4、,SSCP,5、,MSP,6、,测序,二、外源性疾病的检验与诊断：,1,、,细菌、支原体、衣原体、寄生虫、,病毒等,2,、,SARS冠状病毒的分子生物学检测,BNIoutS/BNoutAs:,sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp,BNIinS/BNIAs:,sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bp,SAR1s/SAR1as:,sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AGT GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp,Amplicon sequence,(BNI-1,Bernhard-Nocht Institute,Hamburg,Germany,),TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTAGAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC,SARS-specific primers:Cor-p-F2(+),5CTAACATGCTTAGGATAATGG 3,Cor-p-F3(+)5GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3,Cor-p-R1(-)5CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3,Product size:Cor-p-F2/Cor-p-R1:368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1:348 bp,Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre,382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon,Hong Kong SAR Hong Kong-SAR China,COR-1,COR-2:,sense 5 CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3 antisense 5 AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3 Product size:,310,bp,Queen Mary Hospital,The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong-SAR China,HKU:,sense 5 TACACACCTCAGCGTTG 3 antisense 5 CACGAACGTGACGAAT 3 Product size,182 bps,二、内源性疾病的检验与诊断：,1,、,临床基因变异酶的分子性质研究,1,）,用PCR-SSCP技术发现我国第一例,LDH遗传变异病例,病 例,21岁男性：,LDH：75 U/L,(参考范围：110-240 U/L),其余指标均正常,在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在,48-85,U/L之间,经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。,2n 2,3n 3,4n 4,5n 5,6n 6,2）,LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及 对检验结果的影响,基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。,LDH-A基因变异类型,_,变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响,A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变,A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变,A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失,A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化,A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化,A-20 插入C 移码突变,A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合,A-213 丢失2 bp(CT)移码突变,A-251 丢失20 bp 移码突变,LDH-B基因变异类型,变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响,B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化,B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合,B-103 8bp重复 移码突变,B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合,B-139 丢失2 bp(TC)移码突变,B-145 4bp重复 移码突变,B-147 TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变,B-171 CGC-CCC Arg-Pro 基质结合,B-172 TTT-GTT Phe-Val 基质结合,B-173 CGC-CAC Arg-His P轴的安定性,B-176 ATG-TTG Met-Leu 分子稳定性,B-287 丢失1bp(C)移码突变,B-320 GAT-GTT Asp-Val 电荷变化,3),CK变异的分子性质及对酶活力 的影响,病例,56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科,心电图和临床症状提示AMI,实验室检查：,LDH 6900 U/L (200-400 U/L),LDH-1/LDH-2 1.72,CK 37 U/L(15-130 U/L),CK-MB 0 U/L,RT-PCR结果,外显子2 残基54处,A G,GAC GGC,天冬氨酸 甘氨酸,位于酶结构的第4个-螺旋,4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果,结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊断造成困难；,1）,2、,2、电泳异常带的分子性质研究,1）LDH异常电泳酶谱,M4,H1M3 H2M2 H3M1 H4 (+),LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1,正常,H 缺失,M 缺失,H 变异(slow),H 变异(fast),H 发生变异时，产生H 和h,M4,H1M3 H2M2 H3M1 H4,LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1,H1M3,h1M3,H2M2 H4,h2M2 h1 H3,hHM2 h2 H2,h3 H1,h4,2）,异常电泳酶谱的分子性质,1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，,2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，,3）变异的氨基酸位于分子的表面。,结果：产生异常的电泳结果,3）,异常谱形的分析方法,LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图,血清（浆）同工酶分析,（异常形式）,红细胞、白细胞同工酶分析,正常谱型 异常谱型,免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异）,（+）（-）,LDH-Ig复合物 肿瘤产生LDH 基因分析,LDH H/M 比值的计算,-,LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5,H亚基数 4 3 2 1 0,M亚基数 0 1 2 3 4,%A B C D E,-,计算方法：H=A+3/4 B+2/4 C+D,M=100-H,H/M=H/(100 H),2、,后生性调控标志物,1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式,DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。,2）,启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究,3）,启动子甲基化在分析LDH异常带 分子性质中的首例应用,病例,4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结,血清LDH 升高,异常同工酶带LD2ex,位于 LD1和LD2之间,DNA,mRNA1,mRNA2,a,a,0,0,1 2 3 4 5 6 7,1 2 3 4 5 6 7,谢谢观看,/,欢迎下载,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH,内容总结,分子生物学在检验医学中的应用。经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变，。2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同，。3）变异的氨基酸位于分子的表面。结果：产生异常的电泳结果。谢谢观看/欢迎下载,