发酵工程第四章培养基

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第四章培养基,第一节概述,培养基,是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,一、培养基的组成,分批发酵工艺：,每个阶段的培养基不同,菌种发芽生长,扩大菌体繁殖,发酵罐内的菌体生长,产物合成,（合成培养基）,（复合培养基）,（复合培养基）,（复合培养基）,第一节概述,二、培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性,培养基条件：,是指培养基组成、,pH,值、二价阳离子、阴离子聚合物、表面活性剂和固形物含量。,二、条件与微生物生理学和形态学的相关性,碱性培养基中,：产黄青霉菌的菌丝体短而粗，易成,球状体,。,培养基中加海藻酸或甲基纤维素能诱发产黄青霉菌和黑曲霉菌的菌丝体呈,丝状体,生长。,二价阳离子,促进菌丝体呈,球状,，用阴离子聚合物可以阻止二价阳离子的影响。,锰,能改变黑曲霉菌细胞壁的成份。,柠檬酸发酵中,（黑曲霉菌）,和衣康酸发酵,中（土曲霉菌），球状体的菌丝体产酸最高，而产黄青霉菌发酵青霉素时，丝状体的产量最高。,生物素,改变细胞膜的通透性，减少反馈抑制。（谷氨酸发酵）,青霉素,抑制,G,菌细胞壁形成，而改变细胞的通透性。,表面活性剂,改变细胞的通透性。（酶制剂发酵）,三、配制工业发酵培养基的一般要求,1.,营养物质,组成丰富、浓度适当，满足不同时期的菌体生理需要,。,2.,在一定条件下，各种材料间,不能产生生化反应,，理化性质相对稳定。,3.,粘度适中，具有适当的渗透压,4.,考虑所选材料与代谢产物合成过程的关系，使,主产物,合成达到最高速率，不需要的产物的合成降至最低。,5.,生产过程中,既,不影响通气与搅拌的效果，,又,不影响或少影响产物的分离精制和废物处理。,6.,大规模生产时要考虑材料的成本。,第二节培养基的成分,碳源,氮源,无机盐和微量元素,水,前体,促进剂和抑制剂,消沫剂,一、碳源,凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。一般占菌体干重的,50%,，它既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又是提供微生物生命活动中所需能源的原料。主要有,糖、脂、醇、有机酸其它碳氢化合物,。,葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、淀粉,等是细菌，放线菌，霉菌，酵母善于利用的碳源，几乎所用微生物都能利用葡萄糖。,但是会引起,葡萄糖效应,。,葡萄糖效应：,在过多葡萄糖的情况下，葡萄糖不完全氧化的中间产物如丙酮酸、乳酸等会导致培养基的,pH,下降，从而影响微生物的生长和产物的合成。,蔗糖、麦芽糖、乳糖等双糖,常用于抗生素、氨基酸、有机酸、酶类等的发酵，可用其纯化产品，也可用其糖蜜和乳清。,糊精、淀粉等多糖,可克服葡萄糖效应。且来源丰富、价格低廉。,脂类,一般在培养基中糖类物质缺乏或微生物生长的某个阶段，微生物可利用其生长。,碳酸气、石油、石蜡、天然气、甲醇、乙醇等石油化工产品,二、氮源,是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。是微生物发酵中使用的主要原料之一，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。主要分为,有机氮源和无机氮源,。,常用的有机氮源,：,黄豆粉,、花生饼粉、棉籽饼粉、,玉米浆,、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、菌丝体、酒糟等（含丰富的蛋白质、多肽、游离氨基酸，糖类脂肪、无机盐、维生素及生长因子等，微生物生长迅速）。,有机氮源除了含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸外，还含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长因子等，是较理想的营养物质。,微生物对氨基酸的利用是有选择性的，如缬氨酸既可用于红霉素链霉菌的生长，又可以氮源的形式参加红霉素的生物合成。在螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入,L-,色氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高，但,L-,赖氨酸则完全抑制螺旋霉素的生物合成。,黄豆粉是发酵工业最常用的有机氮源，棉籽粉的应用也较广泛。,生产中常用的玉米浆、麸质粉是玉米淀粉生产过程中的副产物。由于它们的质量波动较大，因而应用受到限制。,有机氮源,成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响。,无机氮源,：成分单一，质量较稳定。,铵盐中的氮,与细胞中有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平，可被菌体直接吸收利用。,硝酸盐中的氮,原子必先还原成氨后，才能被菌体吸收利用。,微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起,pH,的变化。,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫,生理酸性物质,，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为,生理碱性物质,，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的,pH,有积极作用。,选择氮源时,：有机氮源和无机氮源应当,混合使用,。,早期：容易利用易同化的氮源,无机氮源,中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,三、无机盐和微量元素,磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等，低浓度时常呈刺激作用，而高浓度时常表现抑制作用。,通常他们在各种培养基中已经足够：,但不同菌种需求不同,同一微生物在不同生长阶段对这些物质的最适需求量也不同,必需根据实验结果区别控制,主要功能,：,构成菌体成分；,作为酶活性基团的组成部分或维持酶的活性；,调节渗透压、,pH,值、氧化还原电位等；,作为自养菌的能源。,磷：,是构成菌体核酸、核蛋白等细胞质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，又是氧化磷酸化反应的必需元素。磷酸盐既能促进菌体的基础代谢，又能影响许多代谢产物的生物合成。因此磷酸盐是发酵生产中的一种限制性营养成分。,铁：,是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素。过量可降低抗生素的产量，如青霉素发酵中，,Fe2+,含量为,6ug/ml,时，不影响其生物合成，当,Fe2+,含量达,60ug/ml,时，产量下降,30%,，当,Fe2+,浓度达,300ug/ml,时，产量下降,90%,。因此，在铁制发酵罐正式投产之前，需要用未接种的培养基运转几批，来去除罐壁上的铁离子。,锌、镁、钴,等是某些酶的辅酶或激活剂，过量则呈抑制作用。,锌：,是链霉素发酵的必需元素，微量的锌能促进青霉素的发酵，过量则呈现抑制作用。微量的锌能促进菌体生长和链霉素的生物合成。,钠、钾、钙,虽不是微生物细胞的构成成分，但仍是微生物代谢中不可缺少的无机元素。,钠：,可维持细胞渗透压，高含量则对细胞生命活动有一定影响。,钾：,能影响细胞膜的透性。,钙：,可调节细胞透性，还能调节培养液中的磷酸盐含量。,注意事项：,对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑,使用时注意盐的形式（,pH,的变化）,四、前体,某些化合物被加入到培养基后，能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中，而自身的结构并未发生太大的变化，却能提高产物的产量，这类小分子称为,前体,例如，,青霉素,生产中加入玉米浆，其单位从,20U/ml,增加到,100U/ml,，其中的,苯乙胺及其衍生物,和,一些脂肪酸,可以被优先结合到青霉素分子中，构成青霉素分子的组成成分。,除了可以提高产量外，还可以形成不同的青霉素,前体能明显提高产品的产量，在一定条件下还能控制菌体合成代谢产物的流向。但浓度过高，则对菌体的生长有毒副作用。次级代谢产物的前体，有些是菌体不能合成或合成量很少，如合成青霉素,G,的苯乙胺,用法,：前体使用时普遍采用流加的方法,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利,苯乙胺,，一般基础料中仅仅添加,0.07%,前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前提的转化率。,四、促进剂和抑制剂,促进剂,：是一类刺激因子，它们并不是前体或营养物质，这类物质加入或者可以影响微生物的正常代谢，或者促进中间代谢产物的积累，或者提高次级代谢产物的量。,例如：“,九二零,”，促进某些放线菌的生长，缩短发酵周期，提高抗生素的产量。,巴比妥,，增加链霉素产生菌的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶的目的，增加抗生素的积累。,硫氰化苄,，降低产生菌的呼吸，降低代谢速度，抗生素合成增加。,抑制剂,：在发酵过程中通过加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径（改变代谢途径）,促进剂提高产量的机制：,1,）有些促进剂本身是酶的诱导物；,2,）有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善,细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，,3,）也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；,4,）有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,五、水,水占了细胞重量的绝大部分，也是一切化学反应和营养物质传递的介质，所以水的质量对微生物的生长繁殖和产物合成极为重要，因此注意水质对发酵的影响。,水的硬度太大，往往会引起某些营养成分的沉淀。,主要考虑参数包括,pH,值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及物质组成和含量。,六、消沫剂,工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常进行。,消沫剂一般采用表面活性物质,，当泡沫的表面存在有极性表面活性物质形成的双电层时，加入另一种,极性相反的表面活性物质,，可以中和电性，破坏泡沫的稳定性，使泡沫破碎；或者,加入更强极性的物质,与发泡剂争夺泡沫表面上的空间，引起力的不平衡，促使泡沫破碎。,常用的消沫剂,：,天然油脂,、,聚醚类,、高级醇、脂肪酸等,第三节培养基的种类与选择,一、培养基的种类,按生产目的和过程分为：,孢子培养基、种子培养基和发酵培养基,按组成成分：,复合培养基、合成培养基,按状态：,固体培养基、半固体培养基、液体培养基,按用途：,选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基、原生质体再生培养基、抗生素生物效价检测用的生物检测培养基等。,复合培养基：,是采用化学成分还不清楚或不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质,(,例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等,),与一些无机盐组成的培养基。,原料来源丰富,(,大多为农副产品,),、,价格低廉、适于工业化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,按组成成分：,复合培养基、合成培养基,大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖,合成培养基：,是用化学成分和数量完全了解的各种营养物质组成,适合于研究菌种基本代谢过程的物质变化规律以及在,实验室范围,作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。,培养基营养单一，,价格较高，不适合用于大规模工业生产,成分明确、稳定、重复性强，可以减少不能控制的因素,一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长,液体培养基：,常用于大规模的,工业生产。,发酵工业多用作培养种子和发酵的培养基。,根据微生物对氧的要求情况，分别作静止或通风搅拌培养。,在菌种筛选工作和菌种培养工作中，也常用液体培养基进行摇瓶培养,微生物在液体培养基中生长的情况有时也可用作鉴定菌种的参考。,按状态：,固体、半固体培养基，液体培养基,生理代谢,/,菌种筛选,种子培养,发酵培养,固体培养基：,用于,菌种的培养和保存。,是在液体培养基中加入凝固剂配成的，最常用的凝固剂是琼脂。,半固体培养基：,用