分生实验4：质粒的提取和电泳

Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,目的,DNA,片段,质粒,TA,载体,连接,重组质粒,目的,DNA,转化,无质粒的,E.Coli,死亡,有质粒的,E.Coli,存活,含抗生素培养基中生长,重组质粒的鉴定,PCR,开始上课时介绍,2-3min,平板筛选,上次实验小结,1、观察自己组的实验结果：转化平板,*培养板在,37C,培养,12-16h,卫星菌：培养时间过长,2、实验中的难点,*制备效率高的感受态细胞,o,小量制备质粒和电泳分析,实验四,开始实验操作前：本次实验介绍,10-15min,质粒,质粒载体,是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链,DNA,分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状,筛选标记,MCS,（多克隆位点）,复制原点,质粒,1)培养细菌使质粒扩增；,2)收集裂解细菌；,3)分离纯化质粒,DNA。,质粒提取原理,：,质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：,去除蛋白质,去除基因组,DNA,去除,RNA,*酚,-,氯仿抽提法,*,RNase,消化,？,？,质粒,DNA,与基因组,DNA,的区别,大肠杆菌遗传物质,1、部位不同：,2、大小不同：,质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体,DNA,的百分之一。,基因组,DNA,分子量较大，细菌基因组约含3000个基因，5,10,6,bp,。,基因组,DNA,容易断裂线性化,碱裂解法提取质粒的原理,原理：,1,、强,碱,和,SDS,裂解,细菌，细菌中的质粒或基因组,DNA,在碱性条件下发生变性。,2,、怎样去除基因组,DNA？,当加入,酸,性物质进行,中和,时，,质粒,DNA,很快复性，,染色体,DNA,则,和变性蛋白质等缠绕在一起,难以复性而形成沉淀,，经离心随细胞碎片一起去除；,3,、怎样去除蛋白质？（已经学过）,留有质粒,DNA,的上清，经,酚和氯仿去除蛋白质,后,用乙醇,沉淀,质粒,DNA,，即得到质粒,DNA.,1)细胞悬浮液（溶液,I）-,悬浮菌体,50,mmol/L,葡萄糖,25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0,10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0,2)细菌裂解液（溶液,II）,-裂解菌体,0.2mol/L,NaOH,1%SDS,碱裂解法提取质粒试剂,：,3）中和液（溶液,III）,-中和,NaOH,60 ml 5mol/L,醋酸钾,11.5ml,冰醋酸,28.5ml,水,4）20mg/ml RNase-,降解细菌,RNA,工作浓度,30,50,g/ml,其他试剂作用和成分同实验一。,质粒,DNA,的,制备,录像5分钟：（8：208：25）,（,1,）,（,细菌的收获：）,取,1.5 ml,工程菌液6,000,转,/,分，离心,2min,，弃上清。,（,2,）,（,细菌的裂解：）,加入,200,l,预冷的细胞悬浮液（溶液,I,）,悬浮,细菌,加入,200,l,细菌裂解液（溶液,II,），,颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。,注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明,DNA,已经游出。,（,3,）,（中和：）,加入,150,l,中和液，上下颠倒混合后置 冰上,5min,，,12,000,转/分，,4,离心,5min,。,碱裂解法提取质粒操作步骤,开始操作：,（去除蛋白质）,（,4,）将上清移至另一离心管中,(,注意不要混入白色沉淀物,),，加入等体积的,TE,饱和的酚,/,氯仿/异戊醇,(25：24:1),混和液，振荡混匀,1min,，,12,000,转,/,分离心,5min,。,（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿,/,异戊醇,(24:1),溶液，振荡混匀,1min,，,12,000,转,/,分 离心,5min,。,（沉淀,DNA,）,（6）将上层水相移至另一离心管中，加入,2.5,倍体积的无水乙醇，置,-20,沉淀,10,15 min。,上午实验结束,下午实验内容,继续提取质粒：,获取及溶解沉淀的质粒,DNA,2,质粒,DNA,电泳分析：,（,7,）,12,000,转/分离心,5min,。,弃上清，室温干燥质粒,DNA 5-10min,。,（去除,RNA,）,（,8,）用,20,l,含,RNase,的,水溶解质粒,DNA，,轻轻吹打混合,。,37,保温,10min,20,l,质粒,DNA,溶液,取出10,l,放于另一个离心管中备用,剩余10,l,用于下一步酶切,继续实验操作,取,10,l,的质粒,DNA,加,2,l,上样液混匀。,加到,0.8%,琼脂糖凝胶的加样孔内。,电泳条件：,100V 40min,。,电泳结束后照像保存，结果分析。,质粒,DNA,的琼脂糖凝胶电泳,质粒提取方法,质粒的量,质粒的纯度要求,决定使用不同的方法,质粒的大小,质粒过大：温和裂解,质粒大小适中：碱裂解，煮沸法,如：,如：,大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂,小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法,质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等,（满足各种转基因实验的要求）,要求不同的纯化方法,电泳时讲授,10-20min,方法举例：,经典的方法：,CsCl-,溴化乙锭梯度密度离心,特点：纯度最高（可获得高质量的超螺旋质粒,DNA,）、最贵、最麻烦,应用：,大量,制备质粒；基因注射，基因转染等对质粒质量要求高的实验,缺口环状或线状,DNA,闭环质粒,DNA,原理：不同结构和大小的,DNA,参入的溴化乙锭的量不一样从而在,CsCl,梯度密度离心中处于不同的位置,特点：小量质粒制备、最简便、快捷,应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）,测序、转染（细提）,质粒提取试剂盒,常用方法：小量碱裂解法,满足不同需要的试剂盒,纯化原理：离子交换柱层析等,小量制备质粒,kit,大量制备质粒,kit,去除内毒素制备质粒,kit,可用于大部分分生实验,质粒的电泳,质粒,DNA,的3种形式泳动速度:超螺旋线性开环,质粒,DNA,的存在形式有3种:,1,、,共价闭环,DNA,:,常以超螺旋形式存在,2,、,开环,DNA,:,质粒,DNA,两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子,3,、,线性,DNA,:,因质粒,DNA,的两条链在同一处断裂而造成.,开环,超螺旋,线性,重组质粒的鉴定,平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞,提取的质粒,质粒电泳筛选重组质粒,重组质粒的进一步酶切鉴定,质粒电泳,空质粒,重组质粒,重组质粒分子量变大而在电泳中滞后,质粒酶切电泳,a:,酶切前,b:,酶切后,插入片段,注：观察质粒的电泳带型,分析质粒切不开的原因。,