超氧化物歧化酶(SOD)的生产技术

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,项目四:超,氧,氧化物歧化,酶,酶(SOD)的生产,任务一：SOD制备方,案,案的制定,生药1121 第五,组,组2011423242,杨恪鉴,一,.,SOD的概况,二.,SOD的运用,三.,SOD的生产,四.SOD的活力测定,一. SOD的概况,1.SOD,的,的概念,超氧物歧化,酶,酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一,种,种新型酶制,剂,剂。它在生,物,物界的分布,极,极广，几乎,从,从动物到植,物,物，甚至从,人,人到单细胞,生,生物，都有,它,它的存在。SOD被视,为,为生命科技,中,中最具神奇,魔,魔力的酶、,人,人体内的垃,圾,圾清道夫。SOD是氧,自,自由基的自,然,然天敌，是,机,机体内氧自,由,由基的头号,杀,杀手，是生,命,命健康之本,。,。全球118位科学家,发,发表联合声,明,明：自由基,是,是百病之源,，,，SOD是,健,健康之本。,体,体内的SOD活性越高,，,，寿命就越,长,长。,2、SOD,的,的分类,3、,作用原理,基本原理,SOD属于,金,金属蛋白酶,，,，按照结合,金,金属离子种,类,类不同，该,酶,酶有以下三,种,种：含铜与,锌,锌超氧化物,歧,歧化酶（Cu-ZnSOD ）,、,、含锰超氧,化,化物歧化酶,（,（ Mn-SOD ）,和,和含铁超氧,化,化物歧化酶,（,（Fe-SOD ）。,三,三种SOD,都,都催化超氧,化,化物阴离子,自,自由基，将,之,之歧化为过氧化氢与氧气。,人体内的,自,自由基,在细胞由于,自,自由基非常,活,活泼，化学,反,反应性极强,，,，参与一系,列,列的连锁反,应,应，能引起,细,细胞生物膜,上,上的脂质过,氧,氧化，破坏,了,了膜的结构,和,和功能。它,能,能引起蛋白,质,质变性和交,联,联，使体内,的,的许多酶及,激,激素失去生,物,物活性，机,体,体的免疫能,力,力、神经反,射,射能力、运,动,动能力等系,统,统活力降低,，,，同时还能,破,破坏核酸结,构,构和导致整,个,个机体代谢,失,失常等，最,终,终使机体发,生,生病变。,4,.SOD的,理,理化性质,3.1SOD对氰,化,化物和H2O2的敏感,性,性,3.2SOD的吸,收,收光谱特性,3.3SOD稳定,性,性及影响因,素,素,5.SOD,的,的作用,它催化超氧,阴,阴离子转化,为,为H2O2,和,和O2的反,应,应， 即催,化,化超氧阴离,子,子自由基O2-,发生歧化反,应,应， 从而,清,清除O2-,，2O2-,+2H+H2O2+O2， 在,生,生命体的自,我,我保护系统,中,中起着极为,重,重要的作用,，,， 在免疫,系,系统中也有,重,重要的功，,因,因而它能防,御,御氧毒性，,增,增强机体抗,辐,辐射损伤能,力,力，防衰老,。,。,6、测定,超氧化物歧,化,化酶（SOD）的催化,底,底物是O2,，,，一般多,以,以一定时间,内,内产物生成,量,量或底物的,消,消耗量作为,酶,酶活性单位,。,。由于O2,自,自身很不,稳,稳定，且不,易,易制备，测,定,定SOD的,方,方法除少数,采,采用直接法,外,外，一般多,为,为间接法。,常用的有：, 邻苯三,酚,酚自氧化法, 细胞色,素,素C还原法,（,（McCord法）,化学发光,法,法,免疫学方,法,法,电泳法,3.1 SOD对氰化,物,物和H2O2的敏感性,长时间用过,氧,氧化氢处理,可,可使CuZn-SOD,和,和Fe-SOD失活，,而,而Mn-SOD不受影,响,响,3.2 SOD的吸收,光,光谱特性,CuZn-SOD具有,独,独特的紫外,吸,吸收光谱。,由,由于色氨酸,和,和酪氨酸的,含,含量较低，,它,它在280nm处并没,有,有最大吸收,峰,峰。,CuZn-SOD的可,见,见光最大吸,收,收波长都在680nm左右，,这,这反映了,酶,酶分子中Cu,2+,的光学特性,。,。,3.3 SOD稳定性,及,及影响因素,PH、热、,蛋,蛋白酶的影,响,响：SOD,在,在pH5.3,9.6间催化性能,良,良好，在pH4.5pH11间,能,能稳定存在,。,。pH3.6时， CuZn-SOD中95%,的,的Zn要脱,落,落，在pH12.2时，SOD,的,的构象会发,生,生不可逆的,转,转变而使酶,失,失活。,SOD对热,的,的稳定性与,溶,溶液中离子强度有关。当离,子,子强度很低,时,时,即使加,热,热到95, 其活性,损,损失也很少,其,其他因素：SOD活性,受,受饮料的色,泽,泽、成分、,酸,酸碱度、乙,醇,醇含量等多,种,种因素的影,响,响，只有在,无,无色、近中,性,性、无乙醇,饮,饮料中SOD活性较稳,定,定。另外还,发,发现有机溶,剂,剂和Cl对SOD的活,性,性具抑制作,用,用,二 SOD,的,的运用,1.药物,SOD是一,种,种新型的抗,炎,炎症药，,根据SOD作用机,制,制和毒性,试,试验,，它对治,疗,疗因O2-,引起的各,种,种,疾病都有,一,一定的疗,效,效。为此,，,，,SOD可,作,作为抗衰,老,老、抗炎,症,症、自身,免,免疫疾病,患,患者广泛,应,应用的医,药,药品。此,外,外，SOD对治疗,贝,贝切特氏,症,症、心肌,梗,梗塞等血,虚,虚性心脏,病,病、胶原,病,病、新生,儿,儿呼吸困,难,难综合症,、,、防御放,射,射性伤害,等,等也可望,有,有效。,二 SOD的运用,2.添加,剂,剂,国外不少,高,高级化妆,品,品都添加SOD，,国,国内也,有,有数家工,厂,厂或公司,在,在开发和,生,生产SOD化妆品,，,， 如大,宝,宝SOD,密,密，康妮SOD、SOD康,舒,舒达霜剂,等,等。SOD作为化,妆,妆品添加,剂,剂主要有3个优点,：,：,（1）有,明,明显的防,晒,晒效果,（2）可,防,防皮肤衰,老,老，阻止,紫,紫褐质（,老,老年斑）,的,的形成,（3）有,明,明显的抗,炎,炎效果，,对,对防治皮,肤,肤病有一,定,定效果。,国外把SOD作,为,为食品添,加,加剂的例子是,加,加在口香,糖,糖和饮料,中,中。我国,贵,贵州农学,院,院已开发,出,出刺梨SOD饮料,。,。SOD,及,及修饰过,的,的SOD,还,还可作为,外,外用药膏,、,、眼药及,牙,牙膏等的,添,添加剂,二 SOD的运用,3. 生,化,化试剂,国外已有,数,数家公司,如,如Sigma公司,等,等出售SOD试剂,，,，国内也,有,有厂家批,量,量生产SOD试剂,，,， 如中科院上,海,海生化所,东,东风试剂,厂,厂、南京建,成,成生物工,程,程研究所,等,等。此外,，,，SOD,有,有可能作,为,为某些疾,病,病的探针,，,， 如郭,彦,彦等人认,为,为脑瘤组,织,织线粒体Mn-SOD降低,是,是转化细,胞,胞的可靠,生,生化指标,之,之一，,并,并可作为,评,评估脑瘤,分,分化程度,的,的参考。,综上所述，随着人,们,们对SOD更广泛,深,深入的研,究,究，不同,类,类型SOD、SOD修饰物,及,及人工有,机,机合成SOD模拟,酶,酶将在医,疗,疗、保健,、,、食品、,农,农业增产,等,等方面发,挥,挥出更大,的,的作用。,三.SOD的生产,1.SOD酶的提,取,取,称取5克,大,大蒜蒜瓣,，,，加入石,英,英砂研磨,破,破碎细胞,后,后，加入pH7.8,0.05mol/L的,磷,磷酸缓冲,液,液（pH7.8）15ml,，,，继续研,磨,磨20min,使SOD酶,充,充分溶解,到,到缓冲液,中,中，然后6000r/min冰冻离,心,心15min，放,弃,弃沉淀，,取,取上清液,。,。,2.去除,杂,杂蛋白,上清液中,加,加入0.25倍体,积,积的氯仿,乙醇,混,混合液搅,拌,拌15min,6000r/min,离,离心15min，,放,放弃沉淀,，,，得到的,上,上清液即,是,是粗酶液,3.SOD酶的沉,淀,淀分离,粗酶液在,搅,搅拌下缓,慢,慢加入固,体,体硫酸铵,至,至饱和浓,度,度60%,，,，持续搅,拌,拌15min，6000r/min,离,离心15min，,得,得到SOD酶沉淀,三.SOD,的,的,生,生,产,产,4.,将,将,沉,沉,淀,淀,溶,溶,入,入pH7.8,，,，0.05mol/L的,磷,磷,酸,酸,缓,缓,冲,冲,液,液5mL,中,中,，,，,然,然,后,后6000r/min,离,离,心,心15min,，,，,放,放,弃,弃,沉,沉,淀,淀,，,，,取,取,上,上,清,清,液,液,，,，,用,用,凝,凝,胶,胶sephacylS-200,进,进,行,行,纯,纯,化,化,，,，,然,然,后,后,超,超,滤,滤,浓,浓,缩,缩,。,。,5.用,紫,紫外分,光,光光度,计,计测定,浓,浓液的,蛋,蛋白含,量,量,6.将,浓,浓缩冷,冻,冻干燥,后,后即得,成,成品。,四、超,氧,氧化物,歧,歧化酶,（,（SOD）的,测,测定,原理,连苯三,酚,酚在碱,性,性条件,下,下，能,迅,迅速自,氧,氧化，,释,释放出O2-,生成,带,带色的,中,中间产,物,物。在,自,自氧化,过,过程的,初,初始阶,段,段，黄,色,色中间,产,产物的,积,积累在,滞,滞后30-45s后,就,就与时,间,间呈现,性,性关系,。,。中间,产,产物在325nm处,有,有强烈,的,的光吸,收,收，在,有,有SOD存在,时,时能催,化,化生成O2和H2O2，从,而,而阻止,了,了中间,产,产物的,积,积累，,通,通过计,算,算就可,以,以求出SOD,的,的活力,。,。,仪器,紫外分,光,光光度,计,计、pH计,离,离心机,试剂,0.05mol/L连苯,三,三酚溶,液,液：称,取,取3.15g,连,连苯三,酚,酚用0.01mol/L盐,酸,酸溶液,溶,溶解并,定,定容至500ml,p,H=8.3Tris-HCl,缓冲溶,液,液,0.1mol/L,三羟甲,基,基氨基,甲,甲烷（Tris）溶,液,液:NH2C(CH2OH)3121.14,取12.114g,溶,溶解，,定,定容至100ml,0.1mol/L,盐酸:,取,取,8.6(9)ml,浓盐酸,，,，稀释,至,至1000ml,50,毫升,0.1mol/L,三羟甲,基,基氨基,甲,甲烷（Tris）溶,液,液,19.9_,毫升,0.1mol/L,盐酸混,匀,匀并稀,释,释至100毫,升,升。,(保存,温,温度:,常,常温,密,密封避,光,光保存),测定步,骤,骤,酶液的,制,制备,称取6g样品,，,，加于,现,现在冰,箱,箱中放,置,置的缓,冲,冲液,60ml(样,品,品的10倍，,视,视情况,定)，,在,在冰浴,中,中研磨,成,成匀浆,，,，四层,纱,纱布过,滤,滤，滤,液,液经4000r/min,离,离心20min,取,上,上清液,用,用于酶,活,活测定,。,。,连苯三,酚,酚自氧,化,化速率,的,的测定,取4.5ml,缓,缓冲液,，,，在25水,浴,浴中保,温,温15min,加入10,连苯三,酚,酚液,，迅速,摇,摇匀,空白：,取,取4.5ml,缓,缓冲液,，,，在25水,浴,浴中保,温,温15min, 加,入,入10,缓冲液,，迅速,摇,摇匀,倒入光,径,径1cm的比,色,色杯中,，,，在325nm波长,下,下于恒,温,温池中,每,每隔30s测A值一,次,次,计算线,形,形范围,内,内，每1minA的,增,增值，,此,此即连,苯,苯三酚,的,的自氧,化,化速率,，,，要求,自,自氧化,速,速率控,制,制在0.07OD/min,酶活测,定,定,测定方,法,法与测,连,连苯三,酚,酚自氧,化,化速率,相,相同，,取1.5ml,缓,缓冲液,，,，在25水,浴,浴中保,温,温15min,加入3ml,酶,酶液，,加,加入10,连苯三,酚,酚液,，迅速,摇,摇匀,空白：,取,取1.5ml,缓,缓冲液,，,，在25水,浴,浴中保,温,温15min, 加,入,入3ml酶液,，,，加入10,缓冲液,，迅速,摇,摇匀,计算加,酶,酶后连,苯,苯三酚,自,自氧化,速,速率,结果计,算,算,样品酶,活,活单位,表,表示，SOD,酶,酶活单,位,位（U,）,）/g,鲜,鲜重,样品酶,活,活单位=,式中,酶样,品,品在325nm处每,分,分钟光,密,密度变,化,化值,V,反,反应液,体,体积,n,酶,酶液稀,释,释倍数,（,（若酶,液,液足够,多,多，可,不,不稀释,即,即n为1）,五.SOD使,用,用及生,产,产时的,注,注意事,项,项,1.SOD的,安,安全性,大量试,验,验和临,床,床应用,表,表明，,无,无论,何,何种给,药,药方式,，,，除罕,见,见的超,敏,敏反应,外,外，SOD对,人,人体无,毒,毒性。,虽,虽然SOD是Mr在30000,以,以上的,蛋,蛋白质,，,， 但,却,却未发,现,现具有,抗,抗原性,，,， 其,原,原因也,正,正在进,一,一步研,究,究中。,2.SOD生,产,产时的,注,注意事,项,项,2.1,在,在破,碎,碎细,胞,胞时,要,要注,意,意安,全,全，,一,一定,要,要破,碎,碎的,彻,彻底,2.2PH,的,的控,制,制力,度,度很,重,重要,，,，以,及,及在,实,实验,中,中的,温,温度,等,等,2.3,要,要学,会,会正,确,确使,用,用分,光,光光,度,度计,谢谢,！,！,