基因工程的基本操作程序-优质课

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2,基因工程的基本操作程序,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1.,目的基因,符合人们需要，能编码蛋白质的基因,2.,基因文库,P9,将含有某种生物,不同基因,的许多,DNA,片断，导入到,受体菌,的群体中，,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,，称为基因文库。,种类,基因组文库,：,含有一种生物的,全部基因,部分基因文库,：,只包含了一种生物的,部分基因,，,如：,cDNA,文库,某种生物的,全部,DNA,限制酶,DNA,片段,DNA,片段与载体连接,重组,DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,生物,某个发育时期,的,mRNA,单链,DNA,双链,cDNA,片段,重组,DNA,与载体连接,cDNA,文库,反转录酶,DNA,聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA,文库的构建,-,逆转录法：,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,1,，基因组文库内的目的基因：,:,动物细胞的基因可以在植物细胞中表达,真核细胞的基因可以转到真核细胞中表达，原因是受体细胞含有剪切内含子的酶,真核生物的基因转移到原核生物中不能得到表达，原因是原核生物不含有剪切内含子的酶。,所以说基因组文库中的目的基因在生物间的交流是部分基因可以,包括所有的原核生物基因和部分真核基因（取决于受体细胞）,2.,而,cDNA,文库中的目的基因是由,mRNA,逆转录得到的，不含有内含子序列，所以在物种间的基因交流是畅通无阻的,3.,获取目的基因的方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,依据：,目的基因的有关信息。,如：,根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物,mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,（,1,）从基因文库中获取目的基因,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,原理：,_,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,模板,DNA,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,过程：,a,、,变性,（,90-95,）：双链,DNA,在受热下，,_,断裂，形成,_,b,、,复性,（,55-65,）：温度降低，,引物,与单链,DNA,结合，形成局部,_,。,c,、,延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶,的作用下，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,方式：以,_,方式扩增，即,_,条件：前提条件,:_,结果：,指数,2,n,短时间内大量扩增目的基因,已知一段目的基因的核苷酸序列,DNA,复制,PCR,技术,场所,解旋方式,酶,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,高温,解旋酶,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶,（,3,）人工合成法：,在,基因较小，核苷酸序列已知,的情况下，,可以利用,DNA,合成仪,人工合成,化学合成法,反转录法,蛋白质,mRNA,DNA,推测,推测,DNA,DNA,合成仪合成,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法：,二、基因表达载体的构建（,核心,）,1.,目的,A.,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,并,遗传,给子代,B.,同时使目的基因能,表达和发挥作用,2.,基因表达载体的,组成,：,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,质粒,目的基因,限制酶,DNA,连接酶,重组,DNA,3.,基因表达载体的构建过程,（,1,）用,_,切割质粒，使其出现切口露出,_,。,（,2,）用,_,切割目,的基因，使其产生,_,_,。,（,3,）将目的基因插入质粒的,_,处，加入,_,，形成了一个重组,DNA,分子,限制酶,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,三、将目的基因导入受体细胞,-,转化,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,稳定,表达,受体细胞,1,、将目的基因导入,植物,细胞,（,1,）,农杆菌转化法,特点,:,a.,能感染,双子叶,植物和,祼子,植物,对单子叶植物无感染能力,b.Ti,质粒的,TDNA,可转移至受体细胞并,整合到其染色体上,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,整合,植物细胞染色体,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（,2,）,基因枪法,-,单子叶植物,（,3,）花粉通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2,、将目的基因导入,动物细胞,方法：,显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导,入微生物细胞,（,1,）方法：,Ca,2+,处理法（,增加细胞壁通透性,）,（,2,）微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,（,3,）过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,四、目的基因的检测与鉴定,检测（,分子水平,）,:,是否,插入,目的基因,是否,转录,是否,翻译,鉴定,:,个体生物学水平鉴定,（,1,）检测转基因生物染色体的,DNA,上,是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,A,方法,:,DNA,分子杂交,B,过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用,放射性同位素,等作标记,以此做,探针,；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出,杂交带,表明目的基因已插入染色体,DNA,中。,1.,检测,基因探针,通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,(2),检测目的基因,是否转录出了,mRNA,方法,:,分子杂交法,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现,杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,（,3,）检测目的基因,是否翻译成蛋白质,方法,:,抗原,-,抗体杂交,提取,方法抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2.,鉴定（个体生物学水平,）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定,活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA,分子杂交法,DNA,分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子水平,方法,检测对象,非编码区,非编码区,编码区,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,编码区,非编码区,非编码区,mRNA,前体,mRNA,单链,DNA,cDNA,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码系列,。即不含,非编码区,和,内含子,