质粒DNA的提取、酶切及检测

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒,DNA,的提取、酶切及检测,相关知识,基因工程又称,DNA,重组技术,外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作,包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程,基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞,常用到的工具酶,限制性内切酶,连接酶,聚合酶 逆转录酶,DNA,酶和,RNA,酶,结构的三大要素：,多克隆位点,选择标记（耐药性）,独立的复制单位,种类：,质粒,噬菌体,酵母人工染色体（,YAC,）,载 体,质粒,（,plasmid,）,是染色体外小型（1-200,kb）,的,共价、闭合、环状的双链,DNA,分子（,cccDNA），,能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。,常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等,质粒的复制：严紧型复制（,1,n,个,）,松弛型复制（,20,个以上）,实验目的和要求,学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定,DNA,片段的有效方法。,第一部分质粒,DNA,的提取,碱裂解法,一、实验目的,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。,二、实验原理,在,EDTA,存在的条件下，经过,NaOH,和阴离子去污剂,SDS,处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。,此时，细菌染色体,DNA,缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。,而质粒,DNA,则留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（,pH8.0,）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。,含有质粒,DNA,的上清液用乙醇沉淀，获得质粒,DNA,。,三、主要试剂,溶液,I,，,50 mM,葡萄糖,/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA,，,pH 8.0,；,Tris-Cl,控制溶液的,pH,，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。,EDTA,是,Ca2+,和,Mg2+,等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学,试剂,中的主要作用是：抑制,DNase,的活性，,溶液,II,，,0.2 N NaOH/1%SDS,；,NaOH,是最佳的溶解细胞的,试剂,，这是由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化所导致。,SDS,是为下一步操作做的铺垫。,溶液,III,，,3 M,醋酸钾,/2 M,醋酸。,钾离子置换了,SDS,中的纳离子形成了不溶性的,PDS,，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组,DNA,也一起被共沉淀。因为基因组,DNA,太长了。,醋酸中和,NaOH,，因为长时间的碱性条件会打断,DNA,。,平衡酚：氯仿（,1,：1）,作用：,酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚,/,氯仿始终在下层，方便水相的回收,。,乙醇：除去,DNA,水化层，使,DNA,沉淀,TE,缓冲液：溶解,DNA,四、实验步骤,接含,PUC18(,或,pET21a),质粒的单菌落于3,ml LB Amp,+,液体培养基中,37,0,C，190rpm,振荡培养过夜,取,1.5,菌液入,1.5,ml,的,dorf,管中,12000rpm、,离心2,s，,弃上清，收集菌体,100,uL,溶液,I,悬浮菌体（,充分振荡,），室温（或冰浴）,3min,加入200,uL,溶液,II（,轻轻混匀,），冰上静置,3min,裂解菌体,加入150,uL,溶液,III（,轻轻混匀,），冰上静置5,min,质粒,DNA,复性,12000,rpm，,离心5,min，,取上清记录体积到一新管,上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（,振荡混匀,）,12000,rpm，,离心15,min，,取上清记录体积到一新管,（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（,振荡混匀,）,12000,rpm，,离心,2min，,取上清记录体积到一新管,上清加2倍体积的无水乙醇（,充分混匀,），室温,2min,12000,rpm，,离心5,min,沉淀用7,0%,乙醇1,mL,洗涤两次（,振荡混匀、离心,）,12000,rpm，,离心,2min,沉淀风干,沉淀用20,uL TE,溶解，-20,0,C,保存,第二部分 质粒酶切,实验目的,理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具,掌握酶切的基本操作,实验原理,制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过,DNA,连接酶连接，便可获得携带外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。限制性内切酶是能识别双链,DNA,分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。,EcoR,和,Hind,的识别序列和切口是：,EcoR:GAATTC;Hind:AAGCTT,。,G,，,A,等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。,限制性核酸内切酶的命名法,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E.coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌,Rd,菌株用,d,，即,Hin,d,。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d,，,Hin,d,等。,II,型限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸，少数也有识别,5,个核苷酸以及,7,个、,8,个、,9,个、,10,个和,11,个核苷酸的。,II,型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向,“,读,”,都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,EcoRI,的识别顺序为：,5,G,AA|TT_C,3,3,C_TT|AA,G,5,垂直线表示中心对称轴，从两侧,“,读,”,核苷酸顺序都是,GAATTC,或,CTTAAG,，这就是回文顺序（,palindrome,）。,_,和,表示在双链上交错切割的位置，切割后生成,5,G,和,AATTC,3,、,3,CTTAA,和,G,5,二个,DNA,片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而,“,粘合,”,。,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,EcoRV,的识别位置是：,5,GAT,|ATC,3,3,CTA,|TAG,5,切割后形成,5,GAT,和,ATC,3,、,3,CTA,和,TAG,5,。这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,影响核酸限制性内切酶活性的因素,(1)DNA,的纯度；,(2),酶切消化反应的温度；,(3),溶液中离子浓度及种类；,(4),缓冲液的,pH,值。,三、实验操作,加样时，严格操作，做到准确无误。该项操作环节是整个实验的关键之一。,质粒量（,l,）,缓冲液,(l)*,EcoR,1,（,l,）,Hin,d,（,l,）,H,2,O,(l),总体积（,l,）,I,8,2,0,0,10,20,II,8,2,1,0,9,20,III,8,2,0,1,9,20,置于,37,水浴酶解,1,小时。,第三部分琼脂糖凝胶电泳,相关知识,琼脂糖凝胶,琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，透明无紫外吸收,，,因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系,琼脂糖浓度,0.3 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0,线状,DNA,大小/,kb,5-600.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型,DNA,的移动速度次序为：共价闭环超螺旋,DNA（cccDNA）,直线,DNA（LDNA，2,条链发生断裂）开环的双链环状,DNA（ocDNA，1,条链发生断裂）,。,影响迁移率的因素,DNA,分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、,DNA,的构象、所加电压 一般5,V/cm、,电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,常用染料,EB:,溴化乙锭，,能插入,DNA,分子碱基对之间,。,DNA,吸收的260,nm,的紫外光传递给,EB，,或者结合的,EB,本身在300和360吸收的射线，呈橙红色。,EB,染料优点：染色操作简便，快速,；,灵敏度高；可以加到样品中或胶中。,EB,是诱变剂，使用时一定要戴手套。,EB,废液要经过处理才能丢弃。,GoldView I,是一种可代替溴化乙锭（,EB,）的新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链,DNA,呈现绿色荧光。,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测,DNA,的方法和技术。,二、实验原理,核酸,pH8,左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。相同碱基数量的双链,DNA,几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。不同分子量的,DNA,片段泳动速度不一样，可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。,可以分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子。,共价闭环超螺旋,DNA（cccDNA）,直线,DNA（LDNA，2,条链发生断裂）开环的双链环状,DNA（ocDNA，1,条链发生断裂）。,三、实验操作步骤,琼脂糖凝胶的制备,凝胶板的制备,加样,电泳,结果观察,将,0.08g,琼脂糖溶解在,100 ml,的,1TBE,电泳液中,配制成,0.8%,琼脂糖凝胶溶液,当琼脂糖溶液的温度降至,60,80,时，加入,GoldView I,使其终浓度约为,0.1l/ml,混匀后，迅速倾入预先安装好的凝胶板中。,待其凝固后，小心取下梳齿，备用。,加样至样品孔中电泳,调至恒压,80v,，使,DNA,向阳性方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约,1,2cm,处，停止电泳。,紫外灯下观察电泳结果并进行拍照。,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,四、实验结果与讨论,根据观察结果，绘图。,分析自提质粒的情况以及酶切情况。,