课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (2)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,专题,2,微生物的培养与应用,2.2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,两个主要目的：,(1),从土壤中分离出能够分解尿素的细菌；,(2),统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。,尿素分子的立体结构,CO(NH,2,),2,+H,2,O,脲 酶,分解尿素的细菌,:,CO,2,+2NH,3,培养基配方,KH,2,PO,4,1.4g,Na,2,HPO,4,2.1g,MgSO,4,7H,2,O,0.2g,葡萄糖,10.0g,尿素,1.0g,琼脂,15.0g,将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至,1000mL,在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,选择培养基,1,直接计数法：,最常用显微镜直接计数法。,先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。,测定微生物数量的方法：,背景知识,优点：,设备简单、能观察微生物的形态特征。,缺点：,难以计数微小量多的细菌。,一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。,2,间接计数法：,最常用稀释平板计数法。,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据：,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在,30,300,的平板进行计数。,每克样品中的菌株数,=,(CV)M,C,：某一稀释度下平板上生长的平均,菌落数,V,：涂布平板时所用的稀释液的体积,(ml),M,：稀释倍数,统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。,注意：,两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为,10,6,的培养基中，得到以下两种统计结果。,1.,第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为,230,。,2.,第二位同学在该深度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为,21,、,212,和,256,，该同学以这三个平板菌落数的平均值,163,作为统计结果。,实例,1,你认为哪位同学的结果更接近真实值？这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了,3,个平板，但是，其中,1,个平板的计数结果与另,2,个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将,3,个平板的计数值用来求平均值。,?,因此，这两位同学的实验需要改进，在设计实验时，一定要涂布至少,3,个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,说明设置重复组的重要性。,在做本课题的实验时，,A,同学从对应,10,6,倍稀释的培养基中筛选出大约,150,个菌落。但是，其它同学在同样的稀释度下只选择出大约,50,个菌落。,其他同学认为,A,同学的结果有问题。他们分析可能是,A,同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。,实例,2,但是，,A,同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，,A,同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。,你能通过设置对照，帮助,A,同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。,一种方案：可以由其他同学用与,A,同学一样的土样进行实验，如果结果与,A,同学一致，则证明,A,无误；如果结果不同，则证明,A,同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,另一种方案：,将,A,同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,实验设计,土壤中分解尿素的细菌的分离与记数,土壤中某样品细菌的分离与计数,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土,3cm,左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,实验步骤,1,土壤取样,制备,5,个牛肉膏蛋白胨培养基和,15,个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。,实验步骤,2.制备培养基,将,10g,土样加入盛有,90mL,无菌生理盐水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液,1mL,，转移至盛有,9mL,水的无菌试管中，依次等比稀释至,10,7,稀释度，并按照由,10,7,至,10,3,稀释度的顺序分别吸取,0.1mL,进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,实验步骤,3.微生物的培养与观察,将涂布好的培养皿放在,30,下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。,挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否变红。,当菌落数目稳定时，选取菌落数在,30300,的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对,3,个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。,实验步骤,4.细菌的计数,每克土壤样品菌数,=,某稀释倍数的菌落平均数,稀释倍数,细菌培养时所用的稀释液体积,一,无菌操作,1.,取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。,2.,应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。,3.,在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,操作提示,二,做好标记,注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。,三,制订计划,1.,某同学在稀释倍数为,10,6,的培养基中测得平板上菌落数的平均数为,234,，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为,0.1ml,）,(),A.2.34,10,8,B,.2.34,10,9,C.234,D.23.4,练一练,1.,某同学在稀释倍数为,10,6,的培养基中测得平板上菌落数的平均数为,234,，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为,0.1ml,）,(),A.2.34,10,8,B.2.34,10,9,C.234,D.23.4,练一练,2.,用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比,（,）,A.,比实际值高,B,.,比实际值低,C.,和实际值一致,D.,比实际值可能高也可能低,下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是,A.KH,2,PO,4,、,NA,2,HPO,4,、,MgSO,4,.7H,2,O,、葡萄糖、尿素、琼脂、水,B.KH,2,PO,4,、,NA,2,HPO,4,、,MgSO,4,.7H,2,O,、葡萄糖、琼脂、水,C.KH,2,PO,4,、,NA,2,HPO,4,、,MgSO,4,.7H,2,O,、尿素、琼脂、水,D.KH,2,PO,4,、,NA,2,HPO,4,、,MgSO,4,.7H,2,O,、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水,练一练,