资源描述
Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,菌落总数与大肠菌群数测定,菌落总数与大肠菌群数测定,主要内容,菌落总数测定,大肠菌群测定,MPN法原理（拓展内容）,菌落总数测定,掌握菌落总数测定方法,实验原理,不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，,36 ,，,48h,（水产品,30 ,，,72h,），菌落数,菌落总数测定,器材与试剂,样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，1ml吸管，培养皿,菌落总数测定,倾注培养,培养结果,菌落总数测定,实验步骤,5.菌落计数,肉眼观察，可用放大镜，可标记,必要时分区计数，菌落成片者作废,计算方法,某稀释度的菌落数两平板菌落数取平均值,选择菌落数在30300之间的稀释度,（1）仅有一个稀释度在此范围,菌落数稀释倍数,菌落总数测定,计算方法,（2）有两个稀释度在30300之间,菌落数之比2，选较小值,菌落数之比300,取稀释倍数最大者,（4）所有稀释度均30,取稀释倍数最小者,（5）没有任何稀释度在30300之间,选最接近该范围者,结果单位CFU/ml（g）,菌落总数测定,注意事项,1.无菌操作,2.标记,3.何时更换吸管,4.吸吹混匀,5.琼脂培养基保温,6.安全常识,大肠菌群数测定,实验目的,实验原理,36 ，48h，产气（小倒管）,三步法初发酵、复发酵,器材与试剂,样品、无菌生理盐水、LST肉汤，BGLB肉汤,1ml吸管、10ml吸管、试管、小倒管,初发酵,器材与试剂,样品、,225ml,无菌生理盐水、,9ml,无菌生理盐水、双料,LST,肉汤，单料,LST,肉汤，,10ml,吸管、,1ml,吸管、吸球,大肠菌群数测定,实验步骤,1.初发酵,菌落总数与大肠菌群数测定,5.,菌落数稀释倍数,（2）接种至10mlBGLB肉汤中,4.,（4）所有稀释度均300,取稀释倍数最小者,每次划线应该压到上一个区域的23条线,（1）仅有一个稀释度在此范围,x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数,初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,三步法初发酵、复发酵,结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,涂片接种环，挑取菌落，,2.,脱色95%乙醇，30s或至无色为止,吸取样品方法,加注样品,初发酵结果,右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。,实验步骤,3.复发酵,（1）选取产气试管,（2）接种至10mlBGLB肉汤中,（3）培养36，48h,（4）观察指标若产气则报告大肠菌群阳性。,大肠菌群数测定,实验步骤,2.分离培养,（1）制备伊红美蓝平板,45 ，无菌，倾注，15ml,（2）选产酸产气的发酵管,（3）接种至伊红美蓝平板,分区划线法,（4）培养 36，48h,分离培养,器材与试剂,初发酵结果（,4,只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,分区划线法,操作要点,1.划下一个区前必须灭菌接种环,2.划线时接种环同平板呈3040角,3.每次划线应该压到上一个区域的23条线,4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动,大肠菌群数测定,实验步骤,2.分离培养,（5）菌落特征,深紫黑色、有金属光泽,紫黑色、无或略有金属光泽,淡紫红色、中心颜色深,（6）革兰染色、镜检选特征菌落,革兰染色法,器材与试剂,结晶紫、卢戈碘液、,95%,乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,革兰染色法,涂片接种环，挑取菌落，,生理盐水一滴，涂匀,热固定通过火焰若干次,初染结晶紫一滴，1min，水洗,媒染卢戈碘液一滴，1min，水洗,脱色95%乙醇，30s或至无色为止,复染复红一滴，30s,涂片,脱色95%乙醇，30s或至无色为止,（3）培养37，24h,目的对某种细菌进行选择性计数,细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=ex xk/k!,目的对某种细菌进行选择性计数,（3）培养37，24h,划下一个区前必须灭菌接种环,MPN法（Most Probable Number Method）,划下一个区前必须灭菌接种环,淡紫红色、中心颜色深,（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个,初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,取稀释倍数最小者,涂片接种环，挑取菌落，,菌落总数与大肠菌群数测定,（1）选取产气试管,培养24小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数,x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数,4.,分区划线法,热固定,初染,媒染,脱色,复染,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,复发酵,器材与试剂,培养,24,小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,大肠菌群数测定,实验步骤,3.复发酵,（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个,（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液,（3）培养37，24h,（4）观察指标产酸，产气,液体接种,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,大肠菌群数测定,注意事项,1.无菌操作,2.吸管使用,3.洗去染液的方法,4.显微镜保养,5.液体接种,x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数,（3）所有稀释度均300,（5）菌落特征,（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个,划下一个区前必须灭菌接种环,（1）选取鉴定为无芽孢G杆菌的菌落13个,肉眼观察，可用放大镜，可标记,取稀释倍数最小者,（5）菌落特征,分区划线法,细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=ex xk/k!,（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液,菌落总数与大肠菌群数测定,（2）接种至10mlBGLB肉汤中,（3）培养36，48h,右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。,（2）接种至10ml乳糖蛋白胨培养液,涂片接种环，挑取菌落，,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method）,目的对某种细菌进行选择性计数,核心思想泊松分布,实施方法多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method）,1.细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布: P(x=k)=ex xk/k!,x:细菌浓度，k:进入发酵管的细菌数,2.若在n管发酵中，令接种水样量为Vi，阳性管数为Pi，阴性管数为Qi，则该检验结果发生的概率为,其中C为常系数,V为总水样量，x为细菌个数,
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