实验二总糖和还原糖的测定

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验二 总糖和还原糖的测定,(3,，,5,二硝基水杨酸法,),掌握,3,，,5,二硝基水杨酸法测定待测样品的总糖和还原糖含量的基本原理，学会处理,721,型或,722,型分光光度计出现的问题,一、实验目的,二、实验原理,还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。,利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。,本实验是利用,3,，,5,二硝基水杨酸溶液（,DNS,法）与还原糖溶液共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。,三、实验步骤,1,、葡萄糖标准曲线的制定,葡萄糖标准液的配制：准确称取,100mg,分析纯的无水葡萄糖（预先在,105,干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到,100ml,容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为,1mg/ml,。,取,7,支,25250mm,的试管，分别按下表加入试剂：,管 号,0,1,2,3,4,5,6,葡萄糖标准液（,ml,）,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,相当于葡萄糖量,(mg),0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,蒸馏水（,ml,）,2.0,1.8,1.6,1.4,1.2,1.0,0.8,3,5,二硝基水杨酸,(ml),1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,将各管溶液混合均匀，沸水浴加热,5min,，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入,21.5ml,蒸馏水，摇匀。于,520nm,波长处测定,OD,值。以葡萄糖毫克数为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。,2,、样品中,总糖,和,还原糖,含量的测定,（,1,）样品中,还原糖,的提取：,准确称取,10g,新鲜材料（或,2g,材料干样粉末），放在,100ml,烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加,50,60ml,蒸馏水，于,50,恒温水浴中保温,20min,，过滤，将滤液收集在,100ml,容量瓶中，再定容至,100ml,。,（,2,）样品中,总糖,的水解提取：,准确称取,10g,新鲜材料（或,1g,材料干样粉末），放在锥形瓶中，加入,10ml 6 molL-1,盐酸，,15ml,水，在沸水浴中加热,30min,，取出一、二滴置于白瓷板上，加,1,滴碘碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后加入,1,滴酚酞指示剂，以,10%,氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到,100ml,。再精确吸取上述溶液,10ml,于,100ml,容量瓶中，定容至刻度，混匀备用。,（,3,）样品中糖含量的测定：取,7,支,25250mm,试管分别按下表加入试剂：,管 号,空白,还原糖,总糖,0,1,2,3,1,2,3,样品溶液（,ml,）,0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,蒸馏水（,ml,）,2,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,3,5,二硝基水杨酸,(ml),1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,1.5,OD,加完试剂后，与制作标准曲线时相同的操作测定样品糖含量。,四、实验结果,在,Excel,绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准线性方程。,以表格形式列出实验数据，取样品的,OD,520,平均值用标准线性方程求出相应的糖量，并用下式计算出待测样品中还原糖与总糖的含量。,还原糖（,mgg,-1,）,=,还原糖毫克数,提取液总体积（,ml,）,稀释倍数,测定用提取液体积（,ml,）,样品重量（,g,）,总糖（,mgg,-1,）,=,样品水解后还原糖毫克数,提取液总体积（,ml,）,稀释倍数,测定用提取液体积（,ml,）,样品重量（,g,）,五、讨论分析,1,、在被测样品中，还原糖可能是些什么糖？总糖包括哪些？,2,、用来测定总糖的样品，为什么要加盐酸水解？而在其测定前，又为何要用,NaOH,中和？,3,、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么应该同步进行？比色时设,0,号管有什么意义？,六、改进实验建议,附：仪器和试剂,主要仪器：分光光度计，水浴锅，容量瓶，刻度试管，移液管等。,3,5-,二硝基水杨酸试剂：,甲液：溶解,6.9g,结晶酚于,15.2ml 10%,氢氧化钠溶液中，并用水稀释至,69ml,，在此溶液中加,6.9g,亚硫酸氢钠。,乙液：称取,255g,酒石酸钾钠加到,300ml 10%,氢氧化钠溶液中，再加入,880ml 1% 3,5-,二硝基水杨酸溶液。,将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用。在室温放置,7-10,天后使用。,6 molL-1,盐酸,10%,氢氧化钠溶液,酚酞指示剂,碘碘化钾溶液：称取,5g,碘，,10g,碘化钾溶于,100ml,蒸馏水中。,