内吞与内膜系统

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物细胞,胞吞作用,和,内膜系统,的荧光显微观察,植物细胞的吞排作用,细胞伸长生长所需要的物质分别在,内质网,(,如蛋白质、脂类,),和,高尔基体,(,细胞壁的一些组分，如果胶、半纤维素,),合成，运输小泡,胞吐作用分泌至胞外或质膜上,，促进,新的细胞膜,和,细胞壁,的生长,另一方面，在细胞扩展增长过程中一些,过剩的蛋白质、多糖、细胞壁前体物质,等细胞成分，需要通过,胞吞作用,重新回到胞质中使之得以,及时回收，循环利用,，,即细胞的内吞和外排两个过程保持基本的相对平衡,在整个膜泡吞排作用（,cytosis,）中，必须有,能量,的保证。,例如，,膜泡组装形成过程中,的小,G,蛋白，,运输过程,中的细胞骨架及相应的马达蛋白，以及,膜融合过程,中,Rab,蛋白等均发生,GTP,或,ATP,的水解反应。,内膜系统,(endomembrane systems),内膜系统是指,内质网,、,高尔基体,、,囊泡,、,溶酶体,和,液泡,等细胞器。这些细胞器的膜是相互流动的,处于动态平衡,在功能上也是相互协同的。,FM,类染料,FM,类染料是水溶性的苯乙烯类复合物，对细胞无毒性作用，使用方便,常广泛用于质膜和囊泡等的各类研究常用的染料有,FM1-43,（,Ex510/Em626,）和,FM4-64,（,Ex558/Em734,）。,FM,类染料与,质膜,及,内膜细胞器,特异结合后发出高强度的荧光，需要借助,胞吞作用,才能进入细胞内。,FM4-64,在水相中没有荧光,，只有插入脂质生物膜后才显示较强的荧光，胞吞回收的囊泡因吞进细胞内部而被荧光标记，利用这种荧光探针能够对细胞的胞吞过程进行有效标记。,FM,类染料染色原理,一、材料、试剂,1.,材料：,烟草悬浮细胞,2.,试剂：,1,）烟草悬浮细胞培养基,2,）,FM4-64,（膜染料）,3,）叠氮化钠,4,）山梨醇,5,）,ER Tracker-,Blue/White(,内质网的特异染料,),二、实验步骤,取,3,个共聚焦专用培养皿，分别编号、；,往中加入,198 L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,2 L,FM4-64,；,往中加入,178 L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,20 L,山梨醇,；,往中加入,194 L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,4 L,NaN,3,；,置显微镜下观察中的荧光分布模式；,观察完毕中的,FM4-64,后再往中加入,4 L ER Blue/white,；,往、中分布加入,2 L FM4-64,，随后先观察中的荧光分布；,接着再观察中的荧光分布模式；,最后再次观察中,FM4-64,、,ER-Blue/White,双染下的荧光分布。,内膜系统及内吞作用的荧光标记观察,取,3,个共聚焦专用培养皿，分别编号、；,往中加入,178,L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,20,L,山梨醇；,往中加入,194,L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,4,L NaN,3,；,往中加入,198,L,含,BY2,细胞培养液（,1000mL,移液器）和,2,L FM4-64,；,置显微镜下观察中的荧光分布模式；,观察完毕中的,FM4-64,后再往中加入,4,L ER Blue/white,；,往、中分布加入,2,L FM4-64,，随后先观察中的荧光分布；,接着再观察中的荧光分布模式；,最后再次观察中,FM4-64,、,ER-Blue/White,双染下的荧光分布。,三、结果与分析,正常,BY2,的,FM4-64,标记,FM4-64,先标记于,BY2,外周，并随着时间的延长逐渐进入细胞内部。,叠氮化钠,处理的的,BY2,的,FM4-64,标记,叠氮化钠能抑制,BY2,的,呼吸作用,，进而抑制细胞的,内吞作用,，导致,FM4-64,不会进入,BY2,内部，说明,FM4-64,是通过,内吞作用,而不是,扩散,进入,BY2,的。,质壁分离,的,BY2,的,FM4-64,标记,用山梨醇处理,BY2 2-3,分钟，使,BY2,发生质壁分离，证明,FM4-64,是一种,膜,染料。,ER tracker-Blue/white,和,FM4-64,双标记,细胞膜显示红色，而一部分细胞器显示紫色（红色蓝色叠加）表明内吞的,FM,染料部分进入内质网。,实验报告,1,）,FM4-64,染料可以进行什么生理过程及细胞器的标记？,2,）你在实验过程中看到的,FM4-64/,山梨醇预处理及叠氮化钠预处理后再染色的实验现象有何不同，为什么？,