高效毛细管电泳法在药物分析中的运用课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,高效毛细管电泳法在药物分析中的应用,山东药品食品职业学院 任玉红,2010年执业药师继续教育,2024/11/22,该内容共分两部分进行介绍第一部分 概述第二部分 高效毛细管电泳技术的分离模式及应用,2024/11/22,第一部分 概述,高效毛细管电泳法(HPCE)又称毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE）。,是以毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据供试品中各组分之间淌度（单位电场强度下的迁移速度）和（或）分配行为上的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。,2024/11/22,1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；,第一次的自由溶液电泳；一台电泳仪;,Tiselius建立了移动界面电泳，将电泳发展成分离技术。,1948年获得诺贝尔化学奖。,2024/11/22,1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术高效毛细管电泳。,19881989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。,目前，在生命科学、药物分析、以及从小分子、离子到单细胞分析的一系列领域得到了广泛的应用。,2024/11/22,一、高效毛细管电泳法的特点,高效毛细管电泳法是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。,与高效液相色谱法（HPLC）相比，其相同处在于都是高效分离技术，仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：HPCE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，HPCE与HPLC相比，分析速度快；柱效高；所需样品量及流动相用量少；但HPCE仅能实现微量制备，而HPLC可作常量制备；同时，HPCE没有泵输液系统，因此成本相对较低，通过改变操作模式和缓冲液的成分，有很大的选择性，可以根据不同分子性质（诸如大小、电荷数、疏水性等）对极广泛的对象进行有效的分离。而HPLC为达到同样的目的，需要消耗价格昂贵的柱子和大量的溶剂。,2024/11/22,HPCE和普通电泳相比，由于其采用高电场，因此分离速度快；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外，其它类型检测器均已和HPCE实现了连接检测；一般电泳定量精度差，而HPCE和HPLC相近；HPCE操作自动化程度比普通电泳要高，与传统的电泳相比主要有四个特点，即高效、快速、微量和自动化。,2024/11/22,毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱等优点，其突出特点是:,1.仪器简单、易自动化,电源、毛细管、检测器、溶液瓶,2.分析速度快、分离效率高,在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数,3.操作模式多，开发分析方法容易,4.操作方便、消耗少,进样量极少，水介质中进行,5.应用范围极广,2024/11/22,二、毛细管电泳的基本装置与操作,毛细管电泳的基本装置由高压电源、毛细管、检测器、电解质贮液槽、进样器、控制系统及数据处理系统组成。,1温度控制系统；2高压电源；3高压电极槽；4毛细管；5检测器；6低压电极槽；7铂丝电极；8记录/数据处理检测器,2024/11/22,几个主要部分的特点:,进样：最常用的进样方式为流体力学方式和电动方式两种。,分离：分离部件主要包括毛细管、毛细管恒温系统和电源。毛细管材料应具有化学和电学惰性、紫外可见光透光性、柔韧性、强度高和便宜等特性。熔融石英是毛细管的首选材料，最常用的是内径为2575m的毛细管。,检测：紫外可见光检测是最常用的检测方式，但是受到仪器、单波长等因素的限制，目前应用最广泛的是二极管阵列（PDA）检测器。,液体的处理：该系统包括自动进样装置、缓冲液更换系统和缓冲液的水平系统等。,2024/11/22,完成典型的HPCE实验，一般包括以下操作步骤：,移开进样端的电解质贮液槽，换上样品管,使用低压或电迁移方式进样,换电解质贮液槽,加上分离电压,样品分离，用检测器进行检测,2024/11/22,电泳,是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。单位电场下的电泳速度称为淌度或电迁移率。,离子所带电荷越多，解离度越大，体积越小，溶液粘度越小，有效淌度就越大，其电泳速度就越快。这也是电泳分离及其条件选择的根本依据之一。,物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。,三、毛细管电泳法的基本理论,2024/11/22,电渗,高效毛细管电泳操作中一个基本组成部分是电渗流（electroosmosis，EOF）。电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动，来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。,CE所用的石英毛细管柱，在pH3的情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。在高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。,电渗流是毛细管中的溶剂因轴向直流电场的作用而发生的定向流动。,2024/11/22,电渗流的方向,电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：,内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；,内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；,粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF）两种速度的矢量和，正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。,2024/11/22,多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7 倍。,因此，在毛细管电泳中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次CE 操作中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和方向可以影响CE 分离的效率、选择性和分离度，所以成为优化分离条件的重要参数。用来控制电渗流的方法主要有改变缓冲溶液的成分和浓度；改变缓冲溶液的pH 值；加入添加剂；毛细管内壁改性；外加径向电场；改变温度等。,2024/11/22,四、影响高效毛细管电泳分离的因素,1.缓冲溶液,CE中常用的缓冲试剂有：磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐等。缓冲液浓度升高，离子强度增加，电渗流减小，分析效率提高；同时，增强样品的富集现象，从而提高分析灵敏度。,2pH值,pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介质中离解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和分离灵敏度。,2024/11/22,3.分离电压 相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。,4.温度的影响,毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。,5.添加剂的影响,6.进样,2024/11/22,第二部分 高效毛细管法的分离模式及应用,2024/11/22,一、高效毛细管电泳的分离模式,1、毛细管区带电泳(CZE),2、毛细管凝胶电泳(CGE),3、毛细管等速电泳(CITP),4、毛细管等电聚焦(CIEF),5、胶束电动毛细管色谱(MEKC或MECC),6、毛细管电色谱(CEC),2024/11/22,1、毛细管区带电泳 CZE,将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。中性组分彼此不能分离。,正离子在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子在负极最后流出，在这种情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于差速迁移被相互分离。,CZE最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作模式的母体。用以分析带电溶质，如多种蛋白质、肽、氨基酸的分析。,2024/11/22,2、毛细管凝胶电泳 CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。,蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。,特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。,毛细管凝胶电泳分凝胶和无胶筛分两类。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺,称为毛细管无胶筛分。柱便宜、易制备。,2024/11/22,CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离,2024/11/22,1）将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。,2）负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。,3、毛细管等速电泳 capillary isotachophoresis，CITP,2024/11/22,3）不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小，使溶质按其电泳淌度不同得以分离。,4）特点：界面明显，富集、浓缩作用；常用于分离离子型物质，目前应用不多。,2024/11/22,1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,4、胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）,在电场力的作用下，胶束在柱中移动。被分离物质在水和胶束相之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达到分离。,2)电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流 电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；,2024/11/22,3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；,特点：1）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；2)色谱与电泳分离模式的结合。,2024/11/22,1）根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；,2）毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的、稳定的、连续的、线性的 pH梯度；,3）氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；,5、毛细管等电聚焦 CIEF,2024/11/22,4）聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；,5）阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；,6）加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；,7）电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。,毛细管等电聚焦电泳已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体等方面。,2024/11/22,是将细粒径固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁涂覆固定相，以电渗流驱动操作缓冲溶液（流动相），使试样组分在两相间进行分离的电动色谱过程。此模式兼具电泳和液相色谱的模式。CEC可分为开管CEC（即管壁涂渍固定相）和填充CEC。,6、毛细管电色谱 capillary electroosmostic chromatography，CEC,2024/11/22,二、高效毛细管电泳法在药物分析中的应用,高效毛细管技术在药物分析中的应用大致可以分为两部分：,一是原料药的定量、原料药中杂质的测定、药物制剂分析以及对它们稳定性的评价等以药品质量