分子荧光分析法经典课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,1572,：西班牙植物学家,N.Monardes,观察到荧光现象,1855,：,Stokes,研究荧光，提出作为一种分析手段,1865,：,Goppelsroder,首次应用方法,1886,：提出荧与化学结构关系的经验法则,1968,：,Jette,和,West,第一台光电荧光计,1956,：第一台商品化的荧光分光光度计,特点：,1),灵敏度高（,1-100 ppb),：有的可达,0.01ppb,；,2),选择性强；,3),方法简单快速，用样量少,;,4),提供比较多的物理参数。,荧光分析的基本原理,*特点：荧光分析的基本原理,3.1,荧光分析的基本原理,*,分子发光,：,处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能 等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。,荧光和磷光,:,当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出,比吸收波长更长,的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时,随之消失的光叫做,荧光,，不立即消失的光叫,磷光,。,3.1 荧光分析的基本原理*分子发光：处于基态的分子吸收能量,3.1,荧光分析的基本原理,*,分子能级,=,电子能级,(Ee),+,振动能级,(Ev),+,转动能级,(Er),。,电子激发的多重度：,M=2s+1,Pauli,不相容原理：分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。,单重态,:,如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,s=0,M=1,三重态,：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，,s=1,M=3,S,0,S,1,S,2,T,1,T,2,3.1.1,分子发光的产生,3.1 荧光分析的基本原理*分子能级=电子能级(Ee)+振动,*,去活化,发射光子,非辐射跃迁,化学反应,荧光,磷光,振动驰豫,系间跨越,内转换,外转换,激发光去除后，荧光立即消失,激发光去除后，磷光不会立即消失,熄灭或猝灭,3.1,荧光分析的基本原理,3.1.1,分子发光的产生,*去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫系间跨越内,3.1.2,激发光谱和发射光谱,*,激发光谱,:,固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线,I,）,激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！,发射光谱：,固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线,II,或III,),。,荧光(磷光)：,光致发光,，照射光波长如何选择？,吸收池,光源,检测器,单色器,信号显示系统,单色器,3.1.2 激发光谱和发射光谱*激发光谱:固定测量波长(选,荧光激发光谱与发射光谱的特征,*,a.Stokes,位移,在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为,Stokes,位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射之间产生了能量损失。,b.,发射光谱的形状与激发波长无关,分子被激发到高于,S1,的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到,S1,电子态的最低振动能级,尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。,无论激发波长是,1,还是,2,，荧光的波长都是,2,3.1.2,激发光谱和发射光谱,激发光谱的形状与发射波长也无关,荧光激发光谱与发射光谱的特征*a.Stokes位移3.1.2,*,ex,=290nm,(MAX),固定,em,=620nm(MAX),固定,ex,=290nm(MAX),em,=,620nm,(MAX),S,0,4,3,2,1,S,1,4,3,2,1,1,4,1,3,1,2,1,1,1,4,1,4,1,2,1,1,c.,镜像规则,通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等,*ex=290nm(MAX)固定em=620nm(M,*,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,nm,蒽的激发光谱和荧光光谱,*200250300350400450500荧光激发光谱荧光,*,3.1.3,荧光与分子结构的关系,分子荧光产生的必备条件,分子必须能够吸收激发光,分子必须具有一定的荧光量子产率,影响因素：荧光产生过程中，辐射和无辐射过程；,与每一过程的速率常数有关；,k,f,分子结构决定（内因）；,主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。,*3.1.3 荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子,*,n,振动弛豫,激发,n,荧光,（,1,）跃迁类型：,具有,电子跃迁类型的结构,跃迁是产生荧光的主要跃迁类型,较大的摩尔吸光系数,较短的激发态寿命,10,-7,10,-9,s,串越至三重态几率小,*振动弛豫激发 荧光（1）跃迁类型：具有,（,2,）具有大的共轭,键结构,*,共轭度越大，荧光越强。,原因：,共轭体系越大，离域大,键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,化合物,苯,萘,蒽,丁 省,戊 省,ex,max,(nm),205,286,365,390,580,em,max,(nm),278,322,400,480,642,F,0.11,0.29,0.46,0.60,0.52,（2）具有大的共轭键结构*共轭度越大，荧光越强。化合物苯萘,（,3,）具在刚性平面结构,*,0.92,1,0.18,（3）具在刚性平面结构*0.9210.18,*,1,）给电子取代剂加强荧光,（,4,）取代基效应,HN,2,，,NHR,，,NR,2,，,OH,，,OR,，,CN,产生,p,共轭,二苯甲酮：弱荧光、强磷光,S,1,T,1,的,系间窜跃产率接近,1,化合物,苯,苯酚,苯胺,苯基氰,苯甲醚,em,max,(nm),278310,285365,310405,280390,285345,相对荧光强度,10,18,20,20,20,2,）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=0,，,COOH,，,NO,2,不产生,p,共轭,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,*1）给电子取代剂加强荧光（4）取代基效应HN2，N,*,空间位阻对荧光发射的影响,3,）取代基的位置,反式二苯乙烯,强荧光物质,F,=,0.75,F,=,0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯,非荧光物质,*空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯F=,*,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。,（,5,）重原子取代基效应,Cl,，,Br,，,I,S,1,T,1,的系间窜跃由于重原子的存在增强,*含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。（5）,*,*,*,3.1.4,溶液的荧光强度,1,荧光强度与溶液浓度的关系,当,lc,0.05,*3.1.4 溶液的荧光强度1 荧光强度与溶液浓度的关系当,*,2,影响荧光强度的环境因素,1,）溶剂对荧光强度的影响,一般溶剂效应,介电常数、折射率,特殊溶剂效应,溶剂与荧光物质间的特殊作用,溶剂,相对介电常数,荧光峰,/nm,荧光效率,乙腈,38.2,410,0.066,丙酮,21.3,405,0.055,氯仿,5.5,398,0.046,四氯化碳,2.24,390,0.002,巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率,极性增加，荧光效率增加；粘度增加，荧光效率增加,*2 影响荧光强度的环境因素1）溶剂对荧光强度的影响一般溶剂,*,2,影响荧光强度的因素,2,）温度对荧光强度的影响,随着温度的增高，荧光物质溶液的荧光量子产率及荧光强度将降低,不同温度下邻菲啰啉的荧光光谱（在邻二苯中）,碰撞几率增大,粘度降低,*2 影响荧光强度的因素2）温度对荧光强度的影响随着温度的增,3,）介质酸度的影响,*,2,影响荧光强度的因素,具酸或碱性基团的有机物质，在不同,pH,值时，荧光体的存在型体不同，不同的型体,(,分子与其离子,),在电子构型上有所不同，而且基态和激发态所表现出来的酸、碱性也有所差别,苯胺：弱的有机碱,在碱性溶液,pH7,12,中以分子形式存在，蓝色强荧光,在酸性,pH13,以离子形式存在，荧光弱。,3）介质酸度的影响*2 影响荧光强度的因素具酸或碱性基团的,3,溶液荧光的猝灭,*,荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光强度降低的现象,1,）碰撞猝灭：荧光分子与淬灭剂分子碰撞,2,）静态猝灭：荧光分子与淬灭剂分子生成非荧 光配合物,3,）转入三重态猝灭：引入溴、碘、溶解氧,4,）发生电荷转移反应的猝灭：甲基蓝与,Fe,2+,5,）荧光物质自猝灭,3 溶液荧光的猝灭*荧光物质分子其它物质分子相互作用引起荧光,*,3.2,荧光光谱仪,吸收池,光源,检测器,单色器,信号显示系统,3.2.1,荧光光谱仪基本结构,单色器,与紫外,-,可见光谱仪的不同,*3.2 荧光光谱仪吸收池光源检测器单色器信号显示系统3.2,*,光源,1.,光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱,光辐射强度随波长的变化小,有足够长的使用寿命,2.,氙灯光源,常用气体放电灯类型：,氙灯光源 高压汞光源,波长范围：,2001000nm,工作压力：,520 atm,启动电压：,2040KV,使用寿命：,10002000h,最广泛应用的连续光源：,发射波长范围宽 发射光强度大,*光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱2.氙灯,*,单色器,第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需要的光，得到所需要的激发光。,第二单色器：在样品池与检测器之间，滤去溶剂、容器表面散射光，瑞利和拉曼光以及杂质发出的散射光等，获得待测物质发射的荧光。,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,问题：,荧光分光光度计与紫外,-,可见分光光度计有何异同点？,*单色器第一单色器：在光源与样品池之间，滤去不需要的光，得到,*,检测器,光电倍增管,放大倍数：,2,n,5,n,;n=10,10,3,10,7,，最大,10,8,10,9,样品池：液池、荧光池,1.,样品池的材料：与紫外,-,可见分光光度计的吸收池一样,2.,吸收池的形状：紫外,-,可见分光光度计的吸收池两面透光,荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3.,使用注意事项,容易破碎,问题：,紫外,-,可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,沾污问题,*检测器光电倍增管样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫,*,3.3,分子荧光分析法的应用,3.3.1,荧光分析法分类,一、直接荧光法,问题：基体干扰较为严重,芳香族有机化合物分析,二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）,衍生化法或荧光探针法,待测物与衍生化试剂发生化学反应,3.3.2,荧光定性分析,与标准品的激发和发射光谱谱图进行对照,三、荧光分析法特点,1),灵敏度高（,1-100 ppb),：有的可达,0.01ppb,；,2),选择性强；,3),方法简单快速，用样量少,;4),提供比较多的物理参数。,*3.3 分子荧光分析法的应用3.3.1 荧光分析法分类一、,3.3.3,荧光定量分析,*,定量依据,1.,标准曲线法（校准曲线法）,2.,单点校正法（标