微生物研究进展chapter5-分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,二级,三级,四级,五级,2020/7/14,#,第五章 分子生态学方法在,环境,研究领域的应用,农学系生物技术专业课程微生物学研究进展,第五章 分子生态学方法在环境农学系生物技术专业课程微生物学,1,一、微生物分子生态学的理论,二、微生物分子生态学的研究方法,三、展望,一、微生物分子生态学的理论,2,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没,3,微生物研究进展chapter5-分子生态学方法在环境微生物研究领域的应用课件,4,1、传统培养法的瓶颈,微生物多样性被用于监视和预测环境变化,也是新基因资源的重要来源。传统纯培养技术虽然已经帮助人们认识了很多微生物，创造了巨大的财富，但是由于,什么原因？,各种环境中能纯培养的微生物种类非常有限，,远远不能反映出自然界微生物多样性的,丰度和范围,。,一、微生物分子生态学的理论,1、传统培养法的瓶颈 微生物多样性被用于监视和预测,5,2、微生物分子生态学的产生,为了,突破传统纯培养方法的限制,，必须要有一种能,绕过纯培养,这一步的新技术，来推动微生物多样性的研究。,2、微生物分子生态学的产生 为了突破传统纯培养方法的限制，必,6,微生物分子生态学的产生使得微生物,群落,的研究,由细胞水平深入到分子机制研究水平,提出了,微生物分子进化,和,分子适应,等全新概念,使微生物生态学理论更加接近自然本质。,微生物分子生态学的产生使得微生物群落的研究由细胞水平深入到分,7,3、微生物分子生态学的概念,利用,分子生物学技术,手段研究自然界,微生物与生物及非生物环境,之间,相互关系及其相互作用规律,的科学。,主要研究微生物区系,组成,、,结构,、,功能,、,适应性发展,及其,分子机制,等微生物生态学基础理论问题。,3、微生物分子生态学的概念 利用分子生物学技术,8,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没后不断漏油。钻油台所属的英国石油公司近日宣布又发现一处泄漏点，令漏油量多达每日5000桶，是原先估计的5倍，并正逼近美南部4个州的海岸。,墨西哥湾“深海地平线”钻油台2010年4月20日爆炸起火沉没,9,环境微生物群落,微生物代谢生理学方法,生物化学方法,分子生物学方法,呼吸醌指纹法,脂肪酸指纹法PLFA,BIOLOG法,杂交法,基于16SrDNA方法,宏基因组,核酸探针杂交,荧光原位杂交FISH,16S rDNA克隆文库,DGGE/TGGE,SSCP,T-RFLP、ARDRA,RFLP、RISA,RADP、ERIC等,基因芯片技术,二、微生物分子生态学的研究方法,环境微生物群落微生物代谢生理学方法生物化学方法分子生物学方法,10,1、研究路线,1、研究路线,11,分析,方法,方法,类别,原理,优点,缺点,分子,杂交,核酸,探针,杂交,DNA的变性、复性及其,在复性过程中的碱基,配对原则、探针与,靶分子的特异性结合,过程简单,避免PCR偏差,影响杂交分析结果的,因素复杂，,只能用来,检测事先已知其目标,基因序列的微生物,FISH,人工合成的荧光或放射性标记探针与微生,物基因组杂交,操作简单，,可原位检测,，,检测灵敏度高,只能对特定类群的,微生物进行研究,其它,分子,生物,学,方法,RFLP,序列差异引起限制性内切酶 酶切位点,的差异,信息量大,重复性高,周期长，过程繁琐,RAPD,利用随意设计的,非特异引物,简单、迅速,重复性低,ERIC,肠杆菌基因间重复共有序列在不同种属或,者同属的不同种微生物之间的拷贝数和定,位的差异引起两个ERIC之间序列的多态性,结果稳定,重复性好,灵敏度高,PCR反应本身的扩增和,偏差可能会产生假,阳性，,不能对群落中,感兴趣的菌进一步研究,分析方法原理优点缺点分子核酸DNA的变性、复性及其过程简单影,12,分析,方法,方法,类别,原理,优点,缺点,基于,16S,rDNA,的,方法,16S,rDNA,克隆,文库,可以用来揭示,不同物种的,系统进化关系,反映各种微,生物种类构成和亲缘关系,工作量大，成本高，不能对目标种群进行,原位和实时的检测,DGGE,不同的,变性剂,浓,度，解链之后电泳速度将会急剧下降,DNA片段纯化,后可以直接,用于测序,分辨率低，,被分析的片段不能大于400bp,TGGE,温度梯度,，利用不同序列结构的DNA，双链,具有不同的熔点温度Tm,同上,同上,SSCP,长度相同但,序列不同的单链DNA具有空间构,象上的差异,操作比较简便,价格低廉,灵敏度和重现度差，,150400bp最佳,的分离效果,ARDRA,16S rDNA序列的差异，,限制性核酸内切酶酶切,后将得到长度与数量,不同的DNA片段,分辨率高,对图谱进行定量化解析和进行群落,间的比较都十分困难,T-,RFLP,PCR扩增中所用引物的一端或两端带有,荧光,标记,方便快捷,分辨率高,灵敏度高,复杂群落多样性的低估、,影响因素多、,无法对微生物定性分析,RISA,核糖体区间序列多态性,操作简单、序,列多态性丰富,核糖体的拷贝数的不同会产生假阳性,分析方法原理优点缺点基于16S可以用来揭示反映各种微工作量大,13,2、荧光原位杂交（FISH）,利用,生物素或地高辛等非放射性物质,标记探针，并通过荧光直接标记或者荧光素偶联的抗原-抗体检测系统，对DNA或RNA,进行定性或定位分析,。,2、荧光原位杂交（FISH）利用生物素或地高辛等非放射性,14,2、基于16S rDNA的指纹图谱法,为什么选择16S rRNA基因作为微生物进化的遗传标记?,2、基于16S rDNA的指纹图谱法为什么选择16S rRN,15,方法：,16S rDNA克隆文库/ARDRA,DGGE/TGGE,RFLP/T-RFLP,RISA（ITS）,SSCP,方法：16S rDNA克隆文库/ARDRA,16,构建16S rDNA克隆文库,环境样品,提基因组,扩增混合基因组16SrDNA,与载体连接，转入感受态细胞,微生物群落 结构信息,挑取单克隆鉴定是否为阳性克隆,酶切、PCR方法鉴定,全部阳性克隆测序,与数据库序列比对,系统发育分析,阳性克隆鉴定PCR扩增所有16SrDNA片段,两种或两种以上四碱基限制性内切酶酶切,内切酶图谱分型,每种类型挑选1-3个,克隆测序,序列比对及分析,由于,载体与DNA片段一一对应,，可得到单个DNA片段重组质粒，转化时过程中绝大多数感受态细胞只能接受一个外源DNA分子，由此便可达到把混合片段分开的目的,ARDRA,构建16S rDNA克隆文库环境样品 提基因组扩增混合基,17,优点,得到的序列信息比较完整,片段携带的信息量大，结果可靠,适合对环境中微生物群落的整体结构进行分析,缺点,工作量大,不能对目标种群进行原位和实时监测,优点,18,Vinh D.Pham等人用16S rDNA文库结合fosmid方法研究了阿拉斯加某中温油藏采出水中,细菌和古细菌的多样性,，结果表明古细菌和细菌数量均等，,未培养微生物约占检出总量的30%左右,，,检测到的古细菌主要是乙酸型产甲烷古菌,。,佘跃惠等人也用16S rDNA文库结合TGGE方法研究了大港孔店油田注水油藏微生物群落的多样性，,结果表明,注水井中的微生物多样性比采油井中丰富,，注水井样品中的细菌主要属于变形菌门和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲(47%)。采油井样品的细菌主要属于变形菌门,尤其是假单胞菌属(62%)。,通常采用,构建16SrDNA文库方法与其它分子生物学方法联合,，对环境微生物群落结构进行分析。,Vinh D.Pham等人用16S rDNA文库结合fos,19,16S rDNA克隆文库数据分析,根据不同的酶切图谱分型后，,可以得到该,环境样品中的微生物组成信息,。同时，根据每一个OTU所含的克隆数目，也可以推测出该,环境中的优势菌群,。,OTUs,Match_Name,clone number,the ratio of,all clones,genus,OTU1,Methanosaeta thermophila PT,34,27.42%,甲烷鬃菌属,OTU2,Methanolinea tarda,4,3.23%,甲烷绳菌属,OTU3,Uncultured archaeon,1,0.81%,未培养古菌,OTU4,Uncultured archaeon,1,0.81%,未培养古菌,OTU5,Uncultured archaeon,5,4.03%,未培养古菌,OTU6,Uncultured archaeon,7,5.65%,未培养古菌,OTU7,Uncultured archaeon,11,8.87%,未培养古菌,OTU8,Uncultured archaeon,1,0.81%,未培养古菌,OTU9,Uncultured euryarchaeote,1,0.81%,未培养牛瘤胃古菌,OTU10,Uncultured,Methanosarcinales,52,41.94%,甲烷八叠球菌属,OTU11,Uncultured euryarchaeote clone,1,0.81%,未培养牛瘤胃古菌,OTU12,Uncultured crenarchaeote,2,1.61%,泉古菌门,OTU13,Uncultured,Methanosaeta,sp.,1,0.81%,甲烷鬃菌属,OTU14,Uncultured archaeon,2,1.61%,未培养古菌,OTU15,Uncultured archaeon,1,0.81%,未培养古菌,以大庆油田采出水样品古菌文库为例,：,16S rDNA克隆文库数据分析 根据不同的酶切图谱,20,变性梯度凝胶电泳DGGE,产生,：,1979年由Fisher和Lerman最先提出的用于,检测DNA片段中的点突变,的一种电泳技术,原理,：,碱基组成不同DNA序列，其解链温度也各不相同。,由此，便可通过设定不同的变性条件（,变性剂浓度,或者温度）将不同的DNA片段分开。,特点,：,分离大小相同，但碱基组成不同的序列,变性梯度凝胶电泳DGGE产生：,21,16S rDNA的高可变区,E.coli,16S rRNA,二级结构及各可变区,V3区 约170bp,V6-V8区 约350bp,片段大小不同，携带的信息量不同，选择不同的区域得到DGGE图谱不同，群落信息也有差异,不同的片段大小对应的胶浓度也不同,根据需要选择最合适的,提取基因组后，扩增,16SrDNA高可变区,片段,16S rDNA的高可变区E.coli 16S rRNA二,22,确定合适的变性剂范围,对DNA片段进行有效分离,根据,变性剂梯度方向与电泳方向,相同或不同,DGGE分为：,垂直DGGE 平行DGGE,确定合适的变性剂范围对DNA片段进行有效分离根据变性剂梯度方,23,GC-Clamp,调节目的序列的解链行为，为一段,40bp,的高GC含量的片段,常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率。,应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100%。,当,等长的双链DNA分子,在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时,因其,解链的速度和程度与其序列密切相关,;,部分解链的DNA分子的迁移速度随解链程度增大而减小,。,GC-Clamp,16SrDNA,低浓度,高浓度,GC-Clamp 当等长的双链DNA分子在含梯度变性剂,24,DGGE的参数：,胶浓度,取决于片段大小，通常不宜超过500bp,6%胶浓度：400,1000bp,8%胶浓度：200,400bp,10%胶浓度：100,300bp,变性剂范围,不同的样品不同,温度,一般都用