最新43饲料中粗蛋白的测定课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,43饲料中粗蛋白的测定,43饲料中粗蛋白的测定,一、蛋白质的测定方法,2,间接法,通过测定样品中总含氮量推算蛋白质含量（根据：每种蛋白质的含氮量是恒定的，,N6.25,）。,凯氏定氮法（,Kjeldahl,）,89,小时,杜马斯燃烧定氮法（,Dumas Combustion Method,）,9001200,高温燃烧，燃烧过程中产生混合气体，其中的干扰成分被一系列适当的吸收剂所吸收，混合气体中的氮氧化物被全部还原成分子氮，随后氮的含量被热导检测器检测。,3,5,分钟,强碱直接蒸馏法,样品在强碱溶液中消煮，使蛋白质中的不稳定氮素以氨的形式释放出来，在,一定条件下，所释放的氨和样品中的含氮量成正比且有很好的相关性，建立,不稳定氮量与全氮量之间的回归方程。,20,分钟,纳氏试剂比色法,一、蛋白质的测定方法2间接法,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,19,世纪（,1883,）建立的经典方法，结果可靠（最常用的标准方法），凯氏定氮法由于具有测定,总有机氮量,准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的,标准分析方法。,但操作费时（,8,9 h,）,改良方法：加催化剂加快分析速度、仪器改进（自动、半自动凯氏定氮仪）。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量19世纪（1883）建立的经,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.,原理,各种饲料的有机物质在还原性催化剂（如,CuSO,4,，,K,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,或,Se,粉）的帮助下，用浓硫酸进行消化作用，使,蛋白质,和,其它有机态氮,（如氨基酸、酰胺、核酸，在一定处理下也包括硝酸态氨）都转变成,NH,4,+,并与,H,2,SO,4,化合成（,NH,4,）,2,SO,4,，而非含氮物质，则以,CO,2,，,H,2,O,，,SO,2,状态逸出。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.,原理,：,使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；,：将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则,被还原成二氧化硫；,2H,2,SO,4,C,2SO,2,2H,2,O,CO,2,二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。,H,2,SO,4,2NH,3,(NH,4,),2,SO,4,2NH,2,(CH),2,COOH,13H,2,SO,4,(NH,4,),2,SO,4,6CO,2,12SO,2,16H,2,O,样品消化,浓硫酸具有脱水性,浓硫酸具有氧化性,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理2NH2(CH)2,最新43饲料中粗蛋白的测定课件,最新43饲料中粗蛋白的测定课件,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.,原理,消化液在浓碱的作用下进行蒸馏，释放出的氨态氮，用硼酸溶液吸收之并与之结合成为四硼酸铵。,蒸馏,2N,a,OH,(NH,4,),2,SO,4,2NH,3,Na,2,SO,4,2H,2,O,2NH,3,+4H,3,BO,3,=(NH,4,),2,B,4,O,7,+5H,2,O,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理 蒸馏2NaOH,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,1.,原理,以甲基红溴甲酚绿作指示剂，用,HCl,标准溶液（,0.1mol/L,）滴定，根据标准酸的消耗量，即可计算有机氮的含量。而后，根据不同的饲料再乘以一定的系数（通常用,6.25,系数计算），即为粗蛋白质的含量。,滴定,(NH,4,),2,B,4,O,7,+2HCl+5H,2,O=2NH,4,Cl+4H,3,BO,3,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量1.原理 滴定(NH4,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏装置,硫酸铜,硫酸钾,硫酸,2%,硼酸溶液,40%,氢氧化钠溶液,0.2%,甲基红,0.2%,溴甲酚绿,0.2%,甲基红及,0.2%,溴甲酚绿的,1+5,混合指示剂,0.1mol/L,的标准盐酸溶液,(,或,1/2,硫酸溶液,),2.,主要仪器及试剂,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量凯氏定氮瓶（或消化管）及蒸馏,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第一步 样品消化,称取适量样品,0.51g,（含氮量,5,80mg,），无损失,（用滤纸包好）,地,放入干燥凯氏烧瓶或消化管中，加入,0.2g,硫酸铜（,CuSO45H2O,），,3g,无水硫酸钾（或无水硫酸钠）及,10mL,硫酸，轻轻摇匀后进行消化。,（样品,CuSO,4,5H,2,O,K,2,SO,4,浓硫酸）透明蓝绿色,空白试验,：取与处理样品相同量的硫酸铜，硫酸钾，硫酸按同一方法作试剂空白试验。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤空白试验：取与,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第一步 样品消化,硫酸铜,/,无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）,（,1,）,K,2,SO,4,或,Na,2,SO,4,的作用：,提高溶液的沸点而加快有机物的分解；,K,2,SO,4,+H,2,SO,4,=2KHSO,4,2KHSO4=K,2,SO4+H,2,O+SO,3,但硫酸钾加入量不能太大,，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第一步 样品消化,硫酸铜,/,无水硫酸钾（或无水硫酸钠）的作用？（大家想想！）,（,2,）,CuSO4,的作用,催化剂,，,加速氧化分解；,2CuSO,4,=CuSO,4,+SO,2,+O,2,C+2CuSO,4,=Cu2SO,4,+SO,2,+O,2,Cu,2,SO,4,+2H,2,SO,4,=2CuSO,4,+2H,2,O+SO,2,此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。,可以指示消化终点的到达；,下一步蒸馏时作为碱性反应（加入碱量）的指示剂。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第一步 样品消化,注意事项：,总氮测定时,，,消化至关重要。,消化在通风橱中进行（若无通风橱,.,）。,在消化开始时，应控制火力,（,应从低温开始分阶段升温至,360,410,），,保持缓慢沸腾，避免,试样溅于瓶壁，难于消化使氨损失。,实验中要,保证硫酸足量,，否则过多的硫酸钾形成硫酸氢钾，而削弱了硫酸的消化作用,。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第二步 氨的蒸馏,样品分解液定容,试样消煮液令却，小心加,20ml,水，移人,100ml,容量瓶中，冷却后，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容置瓶中，再加水至刻度，作为试样分解液备用。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第二步 氨的蒸馏,蒸馏,蒸汽发生器的准备：,装好定氮装量，于水蒸气发生瓶内装蒸馏水至约,2,3,处，,加甲基红指示液数滴及硫酸数滴，以保持水呈酸性,（水为橙红色，否则补加硫酸，大家想想为什么？）。,加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。,防止水中氨态氮的逸失而影响测定值,。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤防止水中氨态氮,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第二步 氨的蒸馏,蒸馏,硼酸溶液的准备：,向接收瓶内加入,20mL2%,硼酸及,2,滴混合指示剂并使冷凝管下端插入液面下,。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第二步 氨的蒸馏,蒸馏,开始蒸馏：,吸取,10.0mL,样品消化稀释液注入凯氏定氮仪的反应室中，用,10mL,蒸馏水冲洗进样入口，再加,10mL40%,氢氧化钠溶液入反应室（动作要快，以防氨逸出），塞好入口玻璃塞，,在入口处加水密封，防止漏气,。打开水蒸汽发生器与反应室之间的夹子，蒸汽通入反应室使氨气被蒸发出来，并通过冷凝管而进入接收瓶内，以第一滴馏液滴下开始计时，蒸馏,5min,，使冷凝管离开吸收液面，在蒸馏,1min,，用水冲洗冷凝管末端，洗液流入接收瓶中，取下接收瓶。,最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸！,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第二步 氨的蒸馏,注意事项：,凯氏定氮蒸馏过程中，要求,整套装置呈密闭状态,，蒸馏前应检查定氮仪各导管间的连接处是否密闭，以免产生泄露；,测定样品前应清洗蒸馏装置，即用,蒸馏水空蒸一次或数次,；,蒸馏后立即清洗蒸馏器。蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。,蒸馏时，,火力稳定,，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏中途不得停火断汽，否则发生倒吸。加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,3.,测定步骤,第三步 滴定,用微量酸式滴定管，以,0.1,或,0.02mol/L,盐酸标准溶液进行滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色为终点。,空白试验：,同时取,10.0mL,空白消化稀释液,同上操作，以校正药品不纯所发生的误差。,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量3.测定步骤,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,4,结果计算,CP,样品中蛋白质的含量（,%,）；,V,1,样品消耗盐酸标准液的体积（,mL,）；,V,2,空白实验消耗盐酸标准液的体积（,mL,）；,C,盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度（,mol/L,）；,0.014,每毫升盐酸标准液（,1 mol/L,）相当于氮的克数；,m,样品质量（,g,）；,6.25,氮换算为蛋白质的系数（换算系数）。,（大家想想,6.25,是如何计算出来的？）,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量4结果计算,二、凯氏定氮法测定粗蛋白含量,5.,方法的评价,凯氏法的优点是,适用范围广,，可用于动植物的各种组织，器官、各种饲料等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到,较准确,的结果，至今仍被作为标准检验方法。但此法,灵敏度低,，适用于,0.2-1.0mg,氮，操作比较复杂，,所需时间长,。,用凯氏