实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验,2,分离,以尿素为氮源的,微生物,实验2,1,思考：,采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？,如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？,思考：采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？,2,一,.,实验原理,尿素,NH,3,中性 碱性,酚红颜色：,(,酸性,),黄色,红色,(,变色范围,pH6.4-8.2),一.实验原理(变色范围 pH6.4-8.2),3,二,.,实验目的,使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌,(,有脲酶,),通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基,pH,的变化,(,脲酶催化的化学反应,),二.实验目的 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶),4,以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的,NH,3,使培养基的,pH,由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用,尿素,的能力愈强。,以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生,5,三,.,实验步骤,.,倒平板,.,制备一定浓度梯度的细菌悬液,g,土壤,ml,无菌水，振荡，为,-2,稀释液，依次制备,-3,、,-4,、,-5,的土壤稀释液。,.,稀释涂布分离法分离细菌,.,制备无菌的全营养固体培养基和尿素固体培养基,.,培养观察（倒置，,37 24-48h,）,（无菌，,0.1ml,，玻璃刮刀）,三.实验步骤.倒平板.制备一定浓度梯度的细菌悬液g土壤,6,1,、配制培养基,尿素培养基,葡萄糖,0.025g,NaCl 0.12g,K,2,HPO4 0.12g,琼脂糖,0.5g,酚红,0.25g,尿素,10ml,LB,培养基,蛋白胨：,0.25g,酵母提取液：,0.12g,NaCl,：,0.25g,琼脂糖,：,0.5g,对照组,选择培养基,实验组,为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？,1、配制培养基尿素培养基LB培养基对照组选择培养基实验组为什,7,琼脂和琼脂糖,琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为,琼脂糖,和,琼脂果胶,，还含有少量的,含氮,化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：,其主要成分不能被微生物利用；,可使培养基,固化,；,不影响,培养基中其他营养物质被细菌吸收。,实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：,尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用,，有利于对这类细菌的筛选。,琼脂和琼脂糖实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基,8,思考？,思考？,9,选择培养基,加入青霉素的培养基,:,分离酵母菌、霉菌等真菌,加入高浓度食盐的培养基,:,分离金黄色葡萄球菌,不加氮源的无氮培养基,:,分离固氮菌,不加含碳有机物的无碳培养基,:,分离自养型微生物,加入青霉素等抗生素的培养基,:,分离导入了目的基因的受体细胞,添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离,选择培养基加入青霉素的培养基:添加或缺少某种化学成分用于,10,2,、倒平板,2、倒平板,11,制备空白平板,：取,2,个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养,LB,固体培养基,和,尿素固体培养基,，放在超净工作台上，冷却至,60,左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至培养皿中，轻轻摇匀，平放至凝固。,2,、倒平板,制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培,12,实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件,13,在无菌条件下，在将,1g,土样加到装有,99 mL,无菌水的三角瓶中，振荡,10min,，即成,10,-2,土壤稀释液，并依次制备出,10,-3,10,-5,稀释液。例如，若想制备,10,-3,的稀释液，可取,0.5 mL 10,-2,的稀释液。取样时，,尽量只取悬液,，倒入有,4.5 mL,无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。,3,、,制备细菌悬液,在无菌条件下，在将1g土样加到装有9,14,4,、,涂布分离,涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取,0.1 mL,的稀释度为,10,-3,、,10,-4,和,10,-5,的土壤稀释液（细菌悬液），分别加到装有全营养,LB,培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；,再将,保存在,70%,酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，,在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。,4、涂布分离 涂布法分离细菌：在无菌条件下,15,接种,取,0.1ml,菌悬液,接种取0.1ml菌悬液,16,涂布分离,涂布分离,17,按浓度捆成一摞,5,、,37,恒温培养箱 倒置培养,按浓度捆成一摞5、37恒温培养箱 倒置培养,18,实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件,19,实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件,20,实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件,21,四,四,22,实验2：分离以尿素为氮源微生物_附件ppt课件,23,1,、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基,因为琼脂是,未被纯化,的混合物，,内含,一定量的,含氮化合物,。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂,思考题：,1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基 因,24,2,、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用,如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的,NH,3,会使土壤变成碱性，,NH,3,与其他阴离子物质如,SO,4,2,、,CO,3,2,、,NO,3,等形成化合物，则会使土壤板结。,有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中,氮的循环,。,2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用如果土壤中有许多尿素，,25,3,、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。,细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。,3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。细菌向胞外分,26,4,、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落,因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。,这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有 极少数量。,4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数,27,