染色质免疫沉淀

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,染色质免疫沉淀,Chromatin immunoprecipitation,第一页，共三十一页。,基因型决定,(judng),表型,第二页，共三十一页。,破坏,(phui),了基因型也就改变了表型,第三页，共三十一页。,但是，也有一些,(yxi),无法解释的现象,在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况,(qngkung),下，一些生物体的表型却发生了改变。,第四页，共三十一页。,什么,(shn me),是表观遗传学,?,是,DNA,及其染色质环境的稳定改变，这些可遗传的变化,(binhu),并不涉及,DNA,序列的突变。,第五页，共三十一页。,表观,(bio un),遗传修饰,在不影响,DNA,序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以影响个体的发育，而且还可以遗传下去。这类变异被称为“表观遗传修饰”，并被认为是导致,(dozh),遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。,第六页，共三十一页。,染色质重塑,染色质重塑在广义上是指染色质结构的动态调整或重新塑造染色质结构。在一些核内因子作用下，染色质,DNA,与其包绕的,核心组蛋白,之间亲和力的变化或相对位置的改变使得染色质结构变得较为松散，,DNA,更易于暴露。染色质重塑就是通过这样的变化来调控基因的转录。,在狭义上，染色质重塑专指由,ATP,提供能量的、通过依赖于,ATP,的染色质重塑复合物改变组蛋白与,DNA,的结合,(jih),状态，在靠近核心组蛋白的,DNA,表面建立特殊的构象，使转录因子较易于接近,DNA,的过程。,第七页，共三十一页。,染色质免疫沉淀技术,(jsh),的发展使染色质重塑研究得以进步,第八页，共三十一页。,实验,(shyn),目的,学习掌握,(zhngw),染色质免疫沉淀技术的基本原理与关键的操作步骤。,第九页，共三十一页。,实验,(shyn),原理,第十页，共三十一页。,实,验,验,(sh,y,n),流,程,程,一,、,、,交,交,联,联,及,及,染,染,色,色,质,质,DNA,剪,切,切,条,条,件,件,的,的,优,优,化,化,准,备,备,甲醛的作用,细胞的用量,交联条件对实验结果的影响,弃培养液，用预冷至,4,带蛋白酶抑制剂,PMSF,的,1PBS,洗细胞两次，刮细胞到一个,2ml,离心管，,2000rpm,，,4,离心,4min,收集细胞。,第,十,十,一,一,页,页,，,，,共,共,三,三,十,十,一,一,页,页,。,。,甲,醛,醛,的,的,作,作,用,用,在,各,各,种,种,交,交,联,联,试,试,剂,剂,中,中,，,，,甲,甲,醛,醛,（,（,HCHO,）,的,的,应,应,用,用,最,最,为,为,广,广,泛,泛,。,。,甲,甲,醛,醛,的,的,第,十,十,二,二,页,页,，,，,共,共,三,三,十,十,一,一,页,页,。,。,细,胞,胞,的,的,用,用,量,量,通,常,常,2.5,10,8,细,胞,胞,足,足,够,够,进,进,行,行,4,次,免,免,疫,疫,沉,沉,淀,淀,。,。,因,因,此,此,，,，,一,一,般,般,为,为,了,了,保,保,证,证,用,用,量,量,，,，,采,采,取,取,培,培,养,养,多,多,瓶,瓶,细,细,胞,胞,，,，,胰,胰,酶,酶,消,消,化,化,，,，,收,收,集,集,在,在,50ml,离,心,心,管,管,中,中,，,，,培,培,养,养,液,液,重,重,悬,悬,，,，,计,计,数,数,。,。,（,（,一,一,般,般,分,分,装,装,110,7,细胞于一个,EP,管，用于免,疫,疫沉淀反应,）,）。,交联条件对,实,实验结果的,影,影响,对于不同的,细,细胞类型，,甲,甲醛的浓度,、,、交联的长,度,度或者交联,的,的温度,(wnd,),都需要调整,。,。如果交联,不,不充分，会,导,导致不完全,固,固定，则,DNA,片段的平均,长,长度会小于,500bp,。交联过度,时,时细胞染色,质,质难以用超,声,声波破碎，,就,就算延长超,声,声波作用时,间,间也会导致,重,重要原料的,丢,丢失。交联,时,时间如果过,短,短，则交联,不,不完全，产,生,生假阴性，,交,交联时间通,常,常为,5,分钟到,1,个小时，具,体,体时间根据,实,实验而定。,第十三页，,共,共三十一页,。,。,3.,用,500l,预热,至,至室,温,温带,有,有蛋,白,白酶,抑,抑制,剂,剂的,SDS,裂解,液,液重,悬,悬并,裂,裂解,细,细胞,(x,b,o),，冰,浴,浴,10,分钟,；,；,超声,波,波处,理,理剪,切,切染,色,色质,DNA,，使,其,其形,成,成,300-1000bp,即大,约,约相,当,当于,2-5,个核,小,小体,长,长度,的,的片,段,段；,超,超声,条,条件,对,对实,验,验的,影,影响,及,及超,声,声注,意,意事,项,项,设,设置,超,超声,破,破碎,的,的条,件,件,酶,酶消,化,化与,超,超声,消,消化,相,相比,较,较的,区,区别,第十,四,四页,，,，共,三,三十,一,一页,。,。,超声,条,条件,对,对实,验,验的,影,影响,及,及超,声,声注,意,意事,项,项,超声,波,波是,使,使用,机,机械,力,力断,裂,裂染,色,色质,，,，容,易,易引,起,起升,温,温或,产,产生,泡,泡沫,，,，这,都,都会,引,引起,蛋,蛋白,质,质变,性,性，,进,进而,(j,n,r),影响,ChIP,的效,率,率。,所,所以,在,在超,声,声波,断,断裂,染,染色,质,质时,，,，要,在,在冰,上,上进,行,行，,且,且要,设,设计,时,时断,时,时续,的,的超,声,声程,序,序，,保,保证,低,低温,。,。另,外,外，,超,超声,探,探头,要,要尽,量,量深,入,入管,中,中，,但,但不,接,接触,管,管底,或,或侧,壁,壁，,以,以免,产,产生,泡,泡沫,。,。总,超,超声,时,时间,也,也不,要,要太,长,长，,以,以免,蛋,蛋白,降,降解,。,。,第十,五,五页,，,，共,三,三十,一,一页,。,。,设置,超,超声,破,破碎,的,的条,件,件,超声,处,处理,的,的条,件,件通,常,常可,以,以设,置,置为,10,秒每,次,次，,共,共,3-4,次，,功,功率,为,为,50W,时设,置,置为,最,最大,功,功率,的,的,30%,，采,用,用,2mm,超声,头,头。,不,不同,(b,tn),的超,声,声处,理,理仪,器,器的,设,设置,不,不太,一,一样,，,，摸,索,索超,声,声条,件,件时,，,，可,以,以先,固,固定,其,其他,条,条件,，,，先,确,确定,每,每次,超,超声,多,多长,时,时间,不,不会,导,导致,明,明显,发,发热,，,，然,后,后摸,索,索不,同,同,第十,六,六页,，,，共,三,三十,一,一页,。,。,酶消,化,化与,超,超声,消,消化,相,相比,较,较的,区,区别,MicrococcalNuclease,可以,将,将染,色,色质,切,切成,一,一到,第十,七,七页,，,，共,三,三十,一,一页,。,。,Enzyme,和,sonication,处理结,果,果比较,(bjio),第十八,页,页，共,三,三十一,页,页。,超声处,理,理的条,件,件需要,优,优化，,各,各实验,组,组可采,用,用不同,的,的超声,波,波处理,条,条件，,比,比较,(bjio),剪切效,果,果。按,以,以下步,骤,骤操作,比,比较,(bjio),各种条,件,件下的,剪,剪切效,果,果：,a.,将超声,处,处理过,的,的样品,离,离心收,集,集上清,（,（,413000rpm,离心,10,分钟）,，,，加入,10l0.5M,EDTA,、,20l1M,Tris-HCl,pH6.5,、,2l20mg/ml,蛋白酶,K,，,45,孵育,0.5-1,小时；,b.,酚,/,氯仿抽,提,提,一次，,乙,乙醇沉,淀,淀并重,溶,溶于,20l,的,ddH,2,O,中，,1.2,%,琼脂糖,凝,凝胶电,泳,泳检查,。,。,实验组,1,2,3,4,5,6,7,8,超声次数,3,6,9,11,3,6,9,11,超声功率,15W,15W,15W,15W,25W,25W,25W,25W,此页内容不在正常的,ChIP,步骤中,第十九,页,页，共,三,三十一,页,页。,酚,/,氯仿,(lfn),抽提步,骤,骤,按照,1,：,1,体积,(tj),比加酚,/,氯仿充,分,分混匀,后,后离心,，,，取上,层,层水相,至,至新管,，,，加入,1/10,体积,3MNacl,，,2,倍体积,无,无水乙,醇,醇，大,转,转数离,心,心,5min,第二十,页,页，共,三,三十一,页,页。,5.,将超声,处,处理过,的,的样品,在,在,413000rpm,离心,10,分钟收,集,集上清,，,，,10,倍稀释,，,，将其,移,移入一,新,新,(yxn),的,2mlEP,管中；,6.,按照每,2ml,稀释后,液,液体加,入,入,75l,的比例,加,加入,蛋白,A-,琼脂糖,/,鲑精,DNA(50%,混悬液,),，,4,摇动,30,分钟，,预,预处理,，,，,短暂离,心,心,(700-1000rpm4,，小于,1,分钟,),，收集,上,上清液,；,；,Beads,的选择,Input,的设置,7.,向,2ml,上清液,中,中加入,适,适量的,抗,抗乙酰,化,化组蛋,白,白,H3,的抗体,(20,l),，,4,摇动过夜，,阴,阴性对照组,不,不加抗体同,样,样摇动过夜,；,；,抗体的,选,选择,对照的,设,设置,二、免疫沉,淀,淀染色质,DNA,片段,(pindun),第二十一页,，,，共三十一,页,页。,Beads,的选择,(xunz),利用目的蛋,白,白质的特异,抗,抗体,(kngt),通过抗原,-,抗体反应形,成,成,DNA-,蛋白质,-,抗体复合物,，,，然后使用,Agarose beads,或,Magnabeads,沉淀此复合,物,物，特异性,地,地富集与目,的,的蛋白结合,的,的,DNA,片段。再经,过,过多次洗涤,，,，除去非特,异,异结合的染,色,色质后，用,SDS+NaHCO,3,洗脱免疫沉,淀,淀复合物。,Magnabeads,是近年来出,现,现的一种新,型,型,beads,，它使用方,便,便，不像,Agarose beads,那样容易破,裂,裂，所以在,操,操作过程中,更,更简单，而,且,且免去了离,心,心的步骤，,节,节省不少时,间,间。,Millipore,公司最新推,出,出的,MagnaChIP,试剂盒就是,采,采用这种,Magnabeads,。,第二十二页,，,，共三十一,页,页。,免疫,(miny),共沉淀和染,色,色质免疫,(miny),沉淀,input,设置,在进行,(jnx,ng),免疫沉淀步,骤,骤前的样品,第二十三页,，,，共三十一,页,页。,染色质免疫,沉,沉淀抗体,(kngt),的选择,ChIPValidated,第二十四页,，,，共三十一,页,页。,对照,(duzho),的设置,ChIP,实验至少应,设,设立,3,种对照：,未,未经免疫沉,淀,淀的超声处,理,理样本（,input,）；阳性,对,对照。一般,用,用组蛋白抗,体,体或,anti-RNA PolymeraseII,抗体这些比,较,较,(bji,o),保守的在所,有,有细胞中都,能,能结合基因,的,的蛋白的抗,体,体；阴,性,性对照。即,用,用一种无关,抗,抗体（或相,应,应动物的免,疫,疫前血清）,，,，与抗目的,蛋,蛋白质抗体,同,同时分别与,交,交联染色质,样,样本进行免,疫,疫沉淀反应,；,；,选择不与