临床标本的细菌学检验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床标本的细菌学检验,血液标本的细菌学检验,目的要求,1,掌握血液标本的细菌学检验程序和方法。,2,掌握血液标本中常见细菌的检验技术。,器材和试剂,1,标本疑为菌血症患者的血液标本。,2,培养基硫酸镁葡萄糖肉汤、胆汁葡萄糖肉汤、硫乙醇酸钠肉汤、羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、厌氧血琼脂平板、,KIA,、,MIU,、甘露醇发酵管等。,3,试剂,3,过氧化氢、氧化酶试剂、染色液、,5g,片新生霉素药敏纸片。,4,其他沙门菌属诊断血清、新鲜人或兔血浆。,步骤和方法,1,标本采集,怀疑为菌血症的患者，一般应在发病初期采集，或在体温上升期采取；原则上应在抗生素使用前采取，对已开始抗生素治疗的患者可在下次给药前采取；大多由肘静脉采取，对亚急性细菌性心内膜炎的患者采集股动脉血，也可在靠近感染病灶的部位采集。成人采血量每次,5,10ml,，儿童,1,2ml,，分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤,(,需氧培养,),和硫乙醇酸钠肉汤,(,厌氧培养,),培养瓶中，疑为沙门菌引起的肠热症可注入胆汁葡萄糖肉汤，轻轻摇动混匀。血液与培养基的比例应为,1:10,，可使血液中的抗菌物质如原有抗生素、溶菌酶、抗体和补体等充分稀释，不能发挥抗菌活性。,检验程序,常见致病菌检验及报告方式,(1),将血液细菌培养瓶置,35,孵育箱中孵育，每日观察,1,次，连续观察至第,7,天。注意血液细菌培养瓶的变化。,(2),如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查，发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告。,(3),如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。,用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。需氧培养瓶接种羊血琼脂平板、巧克力血琼脂平板，前者做普通需氧培养，后者放人,5,CO,2,环境,35,孵育,24h,；厌氧培养瓶接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，前者置厌氧环境进行,35,、,48h,厌氧培养，后者做普通需氧培养。观察菌落生长情况。,(4),对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性。,如为革兰阴性杆菌，进行氧化酶试验、触酶试验和硝酸盐还原试验，氧化酶阴性、触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种,KIA,、,MIU,培养基，,KIA,、,MIU,培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清做玻片凝集后确认血清型；,KIA,、,MIU,培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，血液中常见革兰阴性杆菌的初步鉴定见表。全面鉴定参见第二章第二节进行鉴定；,氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，疑为非发酵菌，参见第二章第四节进行鉴定。,球菌属或肠球菌属；参见第二章第一节进行鉴定。,(6),报告方式：在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有,细菌生长”；经分离培养，生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养,天，有,细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至,7,天，培养瓶中仍无细菌生长迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌学培养,7,天，无细菌生长”。,注意事项,1,一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉汤增菌液，以中和四环素、链霉素、新霉素、多粘菌素等抗生素，并添加抗菌物质拮抗剂如,5,对氨基苯甲酸,(PABA),拮抗磺胺类、,100IU,50ml,青霉素酶破坏青霉素和加入,0.03,0.05,聚茴香脑磺酸钠,(SPS),灭活氨基糖苷类及多肽类抗生素。,2,对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目翻种后无菌生长，方可报告阴性。,3,为了尽快发现病原菌，在,7,天的孵育期内应至少盲目翻种,2,次，第一次在标本孵育,12,18h,后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。,7,天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种需氧培养均需接种羊血平板和巧克力琼脂平板；厌氧培养接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。,4,血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据。常见的病原菌见表,52,。在同一患者的,2,份血液标本中检出同一细菌；或检出细菌的患者,2,3,周后血清中的相应抗体升高则可作出肯定的病原学结论。一般菌血症由一种细菌引起，但也有同时两种细菌的混合感染、两种细菌或细菌和真菌的先后交替感染情况，有时也会出现不常见的细菌，这些情况不能随意判定为污染菌。,5,采血次数及间隔 在脑膜炎、细菌性肺炎等需马上开始抗菌治疗的急性发热性疾病；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等需紧急手术的患者，应立即从两臂分别取,2,份标本做血液细菌培养。对心内膜炎患者，在,24h,内采血,3,次，每次间隔不少于,30min,；必要时次日再采血,2,次。对不明原因发热者,2,次抽血间隔,60min,；必要时于,24,48h,后再抽血,2,次。因为,1,次血培养不足以说明问题，且会遗漏阳性结果。,呼吸道标本的细菌检验,目的要求,1,掌握上呼吸道标本及下呼吸道标本的细菌学检验程序和方法。,2,了解呼吸道标本的采集方法。,器材和试剂,1,标本痰液标本、咽喉拭子。,2,培养基 血琼脂平板、巧克力琼脂平板、其他常用生化反应管。,3,试剂 氧化酶试剂、,3,过氧化氢、革兰染色液、无菌生理盐水。,步骤和方法,(,一,),标本采集,1,鼻咽拭子鼻咽拭子是将金属棉拭子的前端弯曲，高压灭菌后备用。采集时，患者先用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌跟，取鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口咽部其他组织。,2,咽拭子将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌根，暴露整个口咽部。先用 拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取,1,支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物，或 擦取伪膜等病变部位。,3,痰液标本,(1),自然咳痰法：嘱受检者用清水漱口数次后，用力咳嗽自气管深部将痰液咳出吐 至无菌容器中。对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸人,45,左右的,10,氯化钠水溶液，使痰液容易排出。对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽而取之。,(2),气管镜采集法：用气管镜在肺内病灶处直接吸取标本或用气管刷采取标本。,(3),气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。,检验程序,常见致病菌检验及报告方式,1,痰液标本的检验,(1),肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感染有关。,(2),涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。如发现形态典型、有特殊结构，初步可以确定所属菌属或种的细菌，可直接报告。如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；查见革兰阳性双球菌、矛头状，有明显荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。如果不能直接确定菌属或种的细菌，可报告“痰液涂片查见革兰,性,菌”。如果涂片中均为鳞状上皮细胞，则应视为不合格标本。,注意事项,1,上呼吸道标本要及时送检，防止干燥。采集时要尽量避免正常菌群的污染。,2,鼻咽拭子检查脑膜炎奈瑟菌通常用于带菌者的检查，采集的标本要保温,35,度，防止干燥。最好床边接种，必要时使用卵黄双抗运送液。,3,痰液标本最好采取晨痰。,4,上呼吸道有大量的正常菌群存在，正常情况下这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或某些外在因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。因此要正确评价这些菌群的致病作用并不容易。特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下，致病菌难以检出。因此必须熟练掌握各菌群的特点和数量的关系。,5,白喉棒状杆菌引起的白喉是法定报告的传染病，越早诊断对治疗越有利，同时对 防止扩散有重要作用。因此需迅速而准确的检验。,尿液标本的细菌学检验,目的要求,1,掌握尿液标本的细菌学检验程序和方法。,2,掌握尿液标本的细菌计数方法。,器材和试剂,1,标本临床尿液标本。,2,培养基羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、,KIA,、,MIU,、甘露醇发酵管。,3,试剂,3,过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、,5g,片新生霉素药敏纸片。,4,其他诊断血清、新鲜人或兔血浆。,步骤和方法,1,标本采集正常人的尿液是无菌的，但在尿道口及外阴部位存在正常菌群，在采集尿液标本时，极易引起污染。应遵守无菌操作，避免正常菌群的污染。,采集方法,(1),中段尿采集法：是临床上最常采用的方法。女性患者先以肥皂水清洗，而后用,1,：,1000,的高锰酸钾水溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿,10,20ml,于无菌容器中加盖送检。男性患者应翻转包皮，用,1:1000,新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿,10,20ml,于无菌容器中加盖送检。,(2),导尿法：用导尿管导尿收集,10,20ml,尿液。可以避免污染，但患者难以接受，而且有诱发逆行感染的危险。,(3),肾盂尿收集法：由泌尿科医师在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液。,(4),膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，在患者耻骨联合上用碘酒、酒精消毒后，以无菌注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者。,(5),留尿法：留取,24,小时尿液，取沉淀部分约,100ml,送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。,检验程序,(1),尿液的菌落计数,1),直接计数法：将尿液标本混匀，取,1,滴尿液于载玻片上，覆盖盖玻片，用相差显微镜观察每个视野的细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有,100,个以上的细菌则尿液中的细菌数约为,10,7,菌数,/ml,，每视野有,10,个以上的细菌则尿液中的细菌数约为,10,5,菌数,/m1,，每视野有,1,个以上的细菌则尿液中的细菌数约为,10,4,菌数,/ml,；可同观察细菌的形态和运动情况。也可将,0.001ml,尿液涂布在玻片上进行革兰染色，用油镜观察，如每视野有,1,个以上的细菌则尿液中的细菌数约为,10,5,菌数,/ml,。,2),定量接种法：用定量接种环取尿液，在血平板上连续划线接种；或用无菌移液器吸取,0.1ml,尿液标本用,9.9ml,无菌生理盐水稀释后，取,0.1ml,于血平板上涂布接种，,35,孵箱中孵育,18,24h,，计数平板上生长的菌落数。再计算每毫升尿液中细菌数。,每毫升尿液中细菌数,=,平板上的菌落数,x 1/,接种环含尿量,(ml),3),倾注培养法：取,0.1ml,尿液标本用,9.9mL,无菌生理盐水稀释后，取,1ml,于无菌平皿中，加入已溶化并冷却至,50,的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固后,35,孵箱中孵育,18,24h,，计数平板上生长的菌落数。乘上,100,，即得每毫升尿液中的细菌数。,4),报告方式：平板上如有细菌生长，计数菌落后，报告“每毫升尿液中细菌数为,”,；,如无细菌生长，经,48h,培养后仍无细菌生长，报告“普通需氧培养,48h,无细菌生长”。,(2),普通需氧培养：将尿液标本离心，取沉淀接种于血琼脂和麦康凯平板，,35,孵育,18,24h,，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果选择鉴定试验。,注意事项,1,若革兰阴性杆菌尿液菌落计数,10,5,/ml,可判断为感染，,10,4,/ml,10,5,/ml,为可疑需重复检查。对于革兰阳性球菌而言尿液菌落计数,10,4,/ml,可判断为感染菌。,2,尿路感染一般由单一细菌引起，偶尔也可由一种以上细菌引起。当同一份标本中同时检出三种或三种以上细菌时，标本污染可能性大，需重新留取标本检查。,3,尿液是良好的细菌生长环境，采取后应立即检验，放置时间过长会导致感染菌