0402 细胞培养用液

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 4 Animal Cell Culture,Biology of cells in culture,Fluid for cell culture,Standard cell culture techniques,Establishing a cell line or cell strain,Cell freezing and recovery,Animal Cell Engineering,Section 2,：,细胞培养用液,水和平衡盐溶液,天然培养基,合成培养基,无血清培养基,其它常用液,培养基的配制,一、水和平衡盐溶液,1.,蒸馏水,玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水,尽量减少开启次数,存放时间不宜过长，一般不要超过,2,周,最好现制现用,2.平衡盐溶液balanced salt solution,BSS,主要是由无机盐、葡萄糖组成，它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。,主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。,Ringer、PBS、Hanks or D-Hanks无钙、镁离子,配制离散细胞的消化液和洗涤液时，宜用钙、镁离子含量低的或无钙、镁离子的溶液,可配制成10浓度的贮存液，用时稀释,高压灭菌，冰箱保存,浑浊或沉淀时，应重新配制,成效：维持渗透压；提供缓冲系统；,提供水分和无机盐,要求：和培养物来源的动物血清相似；等渗,如：,平衡盐溶液：无,Ca,2+,、,Mg,2+,的缓冲液,PBS,：,NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na,2,HPO,4,.H,2,O 1.56 g,KH,2,PO,4,0.20,加新鲜配置的三蒸水或去离子水水至,1000 ml,二、天然培养基,培养基培养液是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。,蛙胚延髓组织,培养在青蛙淋巴凝块内,天然培养基,血清：提供营养和生长因子，促进细胞生长繁殖，粘附及中和有毒物质,血浆：支持培养组织块及供给细胞生长的营养物质，现在不常用,组织浸出液：可用鸡胚胎浸出液，含大分子核蛋白质和小分子氨基酸，能促进细胞生长,水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白质经水解得到淡黄色粉末，一般可配制成0.5%溶液。,血清中的主要成分：,多种蛋白质白蛋白、球蛋白、铁蛋白等,多种金属离子,激素,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等,各种生长因子,其它不明成分,优点：,营养成分丰富，培养效果好,缺点：,来源受限。,成分复杂，,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析,。,易发生支原体污染,三、人工合成培养基,常用种类：,RPMI 1640,；,DMEM,；,MEM,；,Eagle,；,199,等,合成培养液的成分,氨基酸 几乎所有细胞在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置20度保存，用前参加培养液内。含谷氨酰胺的培养液在4度贮存2周以上时，应重新参加谷氨酰胺,碳水化合物,维生素,无机离子,其他,培养时要加血清！,四、无血清培养基,无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。,无血清培养基的主要研制策略：在根底培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。,无血清培养基的组成,根底培养液,替代血清的附加成分细胞外基质、激素、生长因子等,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的,。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。,无血清培养基尚处于研究阶段。,目前，大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,。,五、其它常用液,消化液,胰蛋白酶溶液,EDTA,溶液,pH,调整液,NaHCO3,液,HEPES,液,抗生素液,消化液可含0.02%EDTA,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞别离。,胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。,胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks或PBS缓冲液配制；常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。,胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,0.02%,EDTA,溶液,亦称,Versen,液。,化学鳌合剂，对细胞有一定的离解作用。,EDTA,：乙二胺四乙酸二钠,pH,调整液,NaHCO,3,液：,常用浓度,7.4%,、,5.6%,、,3.7%,。三蒸水配制，过滤除菌，塞紧瓶塞保存。,NaHCO,3,+H,2,ONa,+,+HCO,3,-,+H,2,ONa,H2CO,3,OH,-,Na,+,+OH,-,+H,2,O+CO,2,HEPES N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N-ethanesulfonic acid液：一种氢离子缓冲剂，可较长时间保持缓冲作用。可按所需浓度一般1050mM直接参加配制的培养液中。,HEPES是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸MW=238.31，对细胞无毒性,HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。,抗生素液,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制由于操作不慎所致的微生物污染。,通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内最终使用浓度为青霉素100单位/ml、链霉素100微克/ml双抗。,可根据不同的污染物选择抗生素：如，制霉菌素,一般配制成母液，用时稀释！除菌？,计算：,100ml,培养基加,50ul PS,，母液浓度应配成多少？,P每瓶80万U，可配ml母液？相应参加克S？,六、培养基的配制,培养液的种类,生长培养液,根本培养基 80%-90%,血清 10%-20%,抗生素青霉素100单位/ml和链霉素100g/ml,维持液,根本培养基 95%-98%,血清 2%-5%,血清质量好坏是实验成败的关键。,常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。,优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,血清的灭活消除补体活性：56 ，30 分钟,血清的消毒：过滤除菌,培养基的配制举例,RPMI-1640培养粉 1袋,碳酸氢钠 2.0 g,青、链霉素 各100单位毫升,加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。,调节pH值至7.2,加血清终浓度 10,培养基粉末中一般都参加了酚红当溶液酸性时pH小于6.8呈黄色；当溶液碱性时pH大于8.4呈紫红色，一种pH指示剂。,培养基的选择,培养成败的关键,经验法,来自各培养室或文献报道证明哪些培养基对培养某种细胞较适宜，作为自己应用的依据,实验法,多孔培养板做一组克隆形成率和细胞生长曲线,注 意,每一个细胞系都要进行大量，费力，费时的工作后，才能找到适当的培养液配方，对正常细胞，转化细胞，原代培养，建株培养，悬液培养等所选用的培养液、培养方法可能不同。,在开始培养细胞前，应查找有关文献。,