生物技术与功能性油脂全解课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 生物技术与功能性油脂,第一节 微生物油脂,一、能产油脂的微生物,微生物油脂称为单细胞油脂(SCO)。目前研究得较多的是酵母、藻类和霉菌,能产油脂的细菌则较少。,1 富含油脂的酵母菌主要有:油脂酵母(,Lipomyces,)、红酵母(,Rhodotorula,)、假丝酵母(,Candida,)、油脂酵母(,Endomyces Vernalis,)等,含油脂量30%70%。,2富含油脂的丝状真菌有：曲霉属(Aspergillus)(A.ochraceus,Cladosporium fulvum,C.herbarum,Choanphora cucurbitarum)等等，含油量可达菌体干重的25%65%。,第四章 生物技术与功能性油脂,1,3.富含油脂的藻类:,螺旋藻（总脂肪含量约7）、小球藻富含油脂，许多海洋微藻 及巨藻类中均含有EPA或DHA。能产生DHA的自养性藻种主要集中于涡鞭毛藻纲（Dinophylceae）及prymenesiophyceae纲,其他则较少,涡鞭毛藻（Dinoflagellates）的特征为总脂肪中含有极高的DHA（12%34%）；同时亦含有相当数量的EPA。,4.细菌油脂:,大多数产油细菌不产甘油三酸酯,而是积累复杂的类脂,如磷脂、糖脂等。,3.富含油脂的藻类:,2,二、微生物油脂的组成,表 微生物油脂、母乳脂肪和月见草油的脂肪酸组成比较,脂肪酸(%)微生物油脂 母乳脂肪 月见草油,肉豆蔻酸 0.60.8 411 0.10.2,棕榈酸 2528 2025 50,棕榈油酸 12.5 35 0.10.2,硬脂酸 410 57 1.53.5,油酸 4050 2630 611,亚油酸 1013 1220 6580,一亚麻酸 0.212 23 315,-亚麻酸 12 0.10.2,二、微生物油脂的组成,3,三、微生物油脂的生产,（一）发酵条件对油脂生成量的影响,1 温度,一般情况下微生物油脂生成温度与微生物生长适宜温度一致,大多数在2530,而低温培养时生成的不饱和脂肪酸含量增加。,2 生长期,微生物细胞的含油量因培养时间而有显著的差异。,油脂最大收获量的培养条件与细胞油脂最大含量或细胞最大收获量的培养条件一般不同。,三、微生物油脂的生产,4,4,糖浓度和,C/N,一般情况下,培养基中含氮量越高则细胞中蛋白质含量越高；如果培养基中氮浓度一定，含C越高,油脂积累越多。但碳源太多渗透压高不利于菌体生长。,下面列举较好的培养条件：,毛孢子菌属,Trichosporon,和内孢菌属,Endomyces,:7.5%糖，0.0233%氮。,镰刀菌属,Fusarium:,13%糖,0.11%蛋白胨。,红酵母,Rhdotorula gracilis,:100g糖,0.5g氮。,4 糖浓度和C/N,5,5 通风量,油脂是由基质的糖类还原而生成,微生物细胞的增殖也需要大量的氧,因此在深层培养中通入一定的风量是必要的。,6 矿物元素,矿物元素对各种菌株的影响不同,一般来说,在比生长适当浓度稍高的矿物元素浓度下油脂会蓄积,但太高时就被阻止。,（二）微生物油脂生产的原料,碳源：有葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡等,氮源：有胺盐、尿素、玉米浆、硝酸盐等,无机盐：有氯化钾、硫酸镁以及铁、锌等离子,5 通风量,6,工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉工业废液和石油等作为基础发酵液。,菌株大规模培养使用深层培养法。,（三）微生物油脂的提取,1菌体油脂提取方法：压榨和溶剂萃取法,2前处理方法：,1）将干燥菌株与沙一起磨碎,2）稀盐酸处理,将酵母与稀盐酸共煮,细胞分解可得中性脂肪，得率很高。,3）自溶法,如将酵母在50下保温23d,自消化后回收脂肪,4）以乙醇或丙酮使结合蛋白质变性,常用的溶剂有乙醚、异丙基醚等。,工业上一般使用亚硫酸纸浆废液、木材糖化液、废糖蜜、淀粉,7,第二节 一亚麻酸的发酵生产,一、概述,(一),-亚麻酸及其生理作用,1,-亚麻酸(,-Linolenic acid,简称GLA)，为全顺 6,9,12一十八碳三烯酸。,2亚麻酸是人体必需脂肪酸之一，是合成人体一系列前列腺素的前体物质，具有许多重要的生理功能，可用于医药、食品、化妆品等。,将亚麻酸（可用环糊精包埋）添加到食品中可对人体起到如下保健作用:,第二节 一亚麻酸的发酵生产,8,（二）亚麻酸的研究进展,二、利用微生物发酵法生产亚麻酸,（一）,生产方法,发酵法生产亚麻酸是利用某些真菌亚麻酸含量较高的特性,采用生物工程技术选育出菌株，然后以葡萄糖为原料,经斜面、摇瓶、小罐、中罐、大罐等系列无菌培养,获得菌体细胞,再在真空低温不破坏有效成分的条件下干燥得到菌体细胞干粉。这种菌体细胞干粉富含亚麻酸及亚油酸等不饱和脂肪酸,用超临界C0,2,作萃取剂,将亚麻酸萃取出来,就得到不含任何溶剂残余的亚麻酸油。它不仅产量高、成本低,而且纯度也超过了从月见草油中提取的-亚麻酸。,（二）亚麻酸的研究进展,9,（二）亚麻酸产生菌,能用于生产含亚麻酸油脂的微生物属于真菌中的接合菌,包括被孢霉属(,Mortierlla,)、根霉属(,Rhizopus,)、小克银汉曲霉、枝霉属(,Thamidium,)和螺旋藻属(Spirulina)的某些菌株。,1985年日本Osama Suzuki等人对深黄被孢霉(,Mortierella isabdllina,)、拉曼被孢霉(,M.ramanniana,)和矮被孢霉(,M.nana,)进行了含葡萄糖60-400g/L的高浓度碳源发酵培养,结果菌株油脂含量35%70%,脂肪酸中-亚麻酸含量为3%11%。1987年衰岛良一等人用雅致小克银汉霉(,Cunninghamella elegans,)发酵生产-亚麻酸,其含量可达18%左右。,（二）亚麻酸产生菌,10,由于一般野生菌株-亚麻酸的含量较低,所以常需通过育种以得到-亚麻酸高产变异菌株。目前对菌株亚麻酸的产生与调控机制还不很清楚,只能采取传统的物理或化学方法进行随机的诱变育种与随机筛选。,利用螺旋藻生产亚麻酸还需从以下3个方面 来研究提高其产量:,(1)寻找合适的培养条件;,(2)设计合理的培养系统;,(3)选育高产亚麻酸的菌株,由于一般野生菌株-亚麻酸的含量较低,所以常,11,1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸再到-亚麻酸、-亚麻酸以及其他一系列脂肪酸的脱饱和作用,是由几种不同的脱饱和酶在起作用,。1992年Cohen等人发现有几种吡啶族的除草剂能抑制脂肪酸脱饱和,SAN,9785,是3脱饱和的最有效的抑制剂。如能筛选出抗SAN,9785,抑制3脱饱和的菌株,就有可能形成亚麻酸的高产菌株。用此法测出抗SAN,9785,菌株的亚麻酸含量由21.19%提高到23.6%,脂肪酸含量由4.09%提高到6.07%。,1992年Andrew等人发现,由油酸到亚油酸,12,（三）生产工艺要求,1.菌种要求,对用于工业化生产亚麻酸油脂的菌种要求是:,1）单位培养液的菌体得率高(大于20%)；,2）油脂含量接近或超过一般的油料植物(25%50%)；,3）油脂中亚麻酸含量高(5%15%)；,4）适应在高浓度培养基中的发酵培养以达到菌体产量,大、发酵罐利用率高的要求。,（三）生产工艺要求,13,2.发酵条件,菌种培养温度：2830,通风搅拌培养：通气量为2m3/(m3min),搅拌速度 400 r/min,发酵时间：4d,发酵培养液参考配方如下:,葡萄糖 10%,(NH,4,),2,S0,4,0.5%,NaAc 0.3%,KH,2,P0,4,0.1%,MgS047H,2,0 0.05%,酵母膏0.02%和蛋白胨0.01%。,在发酵培养前期菌种主要利用氮源增大细胞体积。从第三天开始以消耗碳源为主,菌体细胞分裂程度剧烈上升,进入对数生长期,同时菌体细胞内油脂蓄积增加。,2.发酵条件,14,（四）油脂抽提,由于油滴存在于菌体细胞内,需采用球磨机或高压匀浆机,将菌体细胞进行机械破碎,。,充分研磨后的破碎菌体干燥后可用CO,2,超临界萃取亚麻酸或先后用乙醇和正己烷分步抽提油脂,也可用氯仿与甲醇按2:1的体积比的混合溶剂抽提油脂。,（四）油脂抽提,15,第三节 发酵法制备EPA与DHA,一、概述,使用微生物大量生产多不饱和脂肪酸,比从海水鱼中提取有明显的优点：,1)藻油中的EPA比鱼油显示出更大的氧化稳定性,而且没有鱼腥味,2)使用基因工程选育菌种有可能大大提高藻类和真菌产生EPA、DHA和其他多不饱和脂肪酸的潜力。,二、产生EPA与DHA的微生物,真菌：被孢霉（,Mortiereua alpina,）,：用于产生EPA,海生真菌脆霉（,Thraustochytrium aureum,）：用于产生DHA。,第三节 发酵法制备EPA与DHA,16,藻类：,角叉菜属（,Chondrum crispus,）、珊瑚藻属(,Corallina officinalis,)、小球藻属(,Chlorella minutissima,)：用于生产EPA,如高山被孢霉(,Mortierella alpina),是进行EPA商业生产的一个潜在来源，这种真菌生长在12的低温条件下,可积累占总脂肪酸15%以上EPA；又如水霉目的脆霉（,Thraustochytrium aureum,）是一种海生真菌,其DHA的含量特别高,占总脂肪酸的34%；如日本种植的一种小球藻（,Chlorellamimutissima,），其油脂中含有90EPA。,藻类：,17,三、微生物体内EPA与DHA的合成途径,多不饱和脂肪酸的合成通常是以单不饱和脂肪酸油酸为底物,合成中有2个主要的反应：,碳链的增长,和,去饱和作用,。,1.碳链的增长：增加碳链长度是通过引入供体乙酰辅酶A或丙二酸辅酶A上的2个碳原子。,2.EPA和DHA的合成途径：,三、微生物体内EPA与DHA的合成途径,18,油酸(C18:1-9),一2H,去饱和,亚油酸(18:2-6),-2H,去饱和,-亚麻酸(C18:3-3),C2,增链,二十碳三烯酸(C20:3-3),-2H,去饱和,二十碳四烯酸(C20:4-3),2H,去饱和,二十碳五烯酸(C20:5-3,EPA),C2,增链,二十二碳五烯酸(C22:5-3),-,2H,去饱和,二十二碳六烯酸(C22:6-3,DHA),图 微生物体内的EPA与DHA的生物合成途径,油酸(C18:,19,四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素,1.,培养基的组成与pH,氮量,：培养基中的氮量会影响绿藻、细菌和真菌生成饱和与不饱和脂肪酸的比例。增加氮含量,EPA比例增加。,C/N,：对于异养微生物(如真菌),氮和碳含量都影响着脂质的产生。高C/N比将增加拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)生成物中多不饱和脂肪酸的含量。,氮源,：不同氮源对微生物体内多不饱和脂肪酸的积累也有影响。,游离脂肪酸,：游离脂肪酸的存在通常会抑制微生物体内其他脂肪酸的合成。,四、微生物合成多不饱和脂肪酸的影晌因素,20,金属离子,：,部分金属离子如Cu,2+,、Zn,2+,、Mn,2,等可促进微生物菌丝体内脂肪酸的合成。,pH,：培养基的初始pH保持在6.07.6有利于真菌和藻类产生EPA。,2.温度、时间、通气量和光照强度,温度,:,1）嗜冷微生物在低于20温度下会产生更多的多不饱和脂肪酸,2）嗜热微生物一般很少产生多不饱和脂肪酸,3）在低温下,能增加蓝绿藻类、细菌、真核藻类、酵母和真菌菌丝体内不饱和脂肪酸的合成。真菌被孢霉仅在低温(1215)下才能产生大量的EPA。,金属离子：部分金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2等可促,21,时间,：在很多微生物体内,不饱和脂肪酸是随着时间的延长而减少。一般微生物在对数生长期的末尾或稳定期的开始,多不饱和脂肪酸浓度达到最大值,在随后的稳定期与衰亡期逐渐减少。,O,2,：,去饱和作用需要分子氧,增加培养基中的氧浓度有助于提高不饱和脂肪酸含量