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,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,3/1/2021,#,重组腺相关,病毒,rAAV,中科院神经所病毒平台,2017,年,1,月,重组腺相关病毒rAAV中科院神经所病毒平台,1,腺相关病毒,（,rAAV,）简介,腺相关,病毒,、,细小,病毒,科,无包膜单链,DNA,病毒,，基因组长约,4.7-6,kb,是迄今发现的一类结构最简单的单链,DNA,缺陷型病毒，通常需要在,辅助病毒的,辅助下才能发生产毒性感染，生成子代,AAV,腺相关病毒（rAAV）简介腺相关病毒、细小病毒科,2,AAV,的基因组及其编码的蛋白,AAV,病毒颗粒示意图；,B,：,AAV,病毒基因组结构（,Kotterman MA et,al.Nat,Rev Genet.2014.,）,AAV的基因组及其编码的蛋白 AAV病毒颗粒示意图；B：AA,3,病毒载体选择指南,Adenovirus,Adeno-associated,Virus,(AAV),Lentivirus,基因组,dsDNA,ssDNA,ssRNA(+),包膜,无,无,有,基因组大小,38-39 kb,5 kb,9 kb,细胞感染,分裂细胞和非分裂细胞,分裂细胞和非,分裂细胞,分裂细胞和非分裂细胞,整合机制,非整合,定向整合,整合,持续时间,3,个月,2,个月,包装能力,7.5 kb,4.5 kb,6 kb,免疫原性,强,弱,一般,滴度,1011-12 vg/mL,1012-13 vg/mL,108-9 vg/mL,转导效率,100%,70%,70%,病毒载体选择指南 AdenovirusAdeno-asso,4,AAV,载体的优势与局限,优势,安全性高,无致病性、不整合、低免疫原性,表达时程长,5,个月高效稳定表达,嗜性广,分裂及非分裂细胞（神经元）、多种血清型实现不同靶向,局限,外源基因容载能力有限,4.7 Kb,通用启动子高表达外源基因的毒性,AAV载体的优势与局限优势局限,5,rAAV,三质粒,制备,系统,A,：,rAAV,载体原理（,Kotterman MA et al.Nat Rev Genet.2014.,）,；,B,：制备,rAAV,的三质粒系统示意图（,Ayuso E et al.Curr Gene,Ther,.2010.,）,rAAV三质粒制备系统 A：rAAV载体原理（Kot,6,传统,三质粒制备,AAV,系统的,缺陷,生产能力低,10,3,-10,4,vg/cel,难满足灵长类研究及临床需求,病毒质量不稳定,多批次包装条件不均一,纯化过程导致的空壳率不可控,传统三质粒制备AAV系统的缺陷生产能力低,7,新型,rAAV,杆状病毒制备系统,杆状病毒系统制备,rAAV,的流程图,新型rAAV杆状病毒制备系统杆状病毒系统制备rAAV的流程,8,新型,AAV,杆状病毒制备,体系,的优势,灵活性高、通用性强、病毒质量高、产量高，适于大规模放大生产，,rAAV,纯化后能够达到很高的纯度，可有效解决,非人灵长类动物神经环路标记的大量需求。,纯化后的,rAAV,病毒经过,扫描电镜检测,，,完整的,rAAV,颗粒比例大于,85%,，病毒质量高,。,纯化,后的,rAAV,处理后进行,SDS-PAGE,凝胶电泳考马斯亮蓝染色检测,，可以观察到明显的病毒粒子衣壳蛋白,VP1,，,VP2,，,VP3,所对应的,1:1:10,比例组成的三种蛋白，分子量与预期一致，,纯度高于,95%,。,新型AAV杆状病毒制备体系的优势灵活性高、通用性强、病毒质量,9,AAV,的,血清型,与其对细胞组织的转导特性,不同血清型,AAV,对小鼠组织细胞的嗜性差异很大（,Karen Kozarsky et al.Nat Methods.2010.）,AAV的血清型与其对细胞组织的转导特性不同血清型AAV对小鼠,10,rAAV,的应用,-,视网膜内界膜细胞的感染,在内界膜注射,rAAV2-CBA-GFP,，病毒感染效果图。,A,：在注射部位，大部分的视网膜神经细胞病毒表达水平都很高；,B:,视网膜,muller,细胞和双极细胞均检测到信号（,Boye SE et al.Hum Gene Ther.2016,）,rAAV的应用-视网膜内界膜细胞的感染在内界膜注射 rAAV,11,rAAV,在,肝脏纤维化研究中的应用,rAAVX-EYFP,感染肌成纤维细胞,效果图（,Rezvani M et al.Cell Stem Cell.2016.,）,rAAV在肝脏纤维化研究中的应用rAAVX-EYFP感染肌成,12,rAAV,的应用,-,脑中枢神经元的感染,rAAV-GFP,注射海马感染效果图（,Broekman ML et al.Neuroscience.2006.,）,rAAV的应用-脑中枢神经元的感染rAAV-GFP注射海马感,13,rAAV,的应用,-,神经元投射研究,rAAV,注射红核区，分别在,7 d,和,30 d,观察转导效率和感染,RN,细胞的特异性（,Blits B et al.J Neurosci Methods.2010.,）,rAAV的应用-神经元投射研究rAAV注射红核区，分别在7,14,rAAV,的应用,-,心脏心肌细胞的感染,不同血清型不同滴度的,rAAV,病毒感染心肌细胞（,Prasad KM et al.Gene Therapy.2011.,）,rAAV的应用-心脏心肌细胞的感染 不同血清型不同滴度的rA,15,rAAV,的应用,-,骨骼肌细胞感染,AAV-lacZ,注射肌细胞，原位杂交检测病毒的表达量（,Kessler PD et al.PNAS.1996.,）,rAAV的应用-骨骼肌细胞感染AAV-lacZ注射肌细胞，原,16,rAAV,的应用,-,肺部细胞的感染,在,CMV,和,RSV,启动子调控下,AP,在肺部的表达情况（,Halbert CL et al.Hum Gene Ther.2007.,）,rAAV的应用-肺部细胞的感染在CMV和RSV启动子调控下A,17,rAAV,的应用,-,神经示踪,图,a.,利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背外侧被盖区（,LDT,）中,PV,阳性和,SOM,阳性中间神经元的直接调控网络示意图；图,b.LDT,中,PV,阳性和,SOM,阳性中间神经元都接受来自外侧僵核（,LHb,）的直接调控,(Yang H et al.Nat Neurosci.2016.,）,rAAV的应用-神经示踪图a.利用狂犬病毒系统逆向追踪小鼠背,18,rAAV,的应用,-,神经示踪,利用,AAV,和狂犬病毒,RV,逆向跨单突触系统研究杏仁核基底外侧核后部至腹侧海马,CA1,区之间存在丰富的谷氨酸能兴奋性单突触输入（,Yang Y et al.Nat Commun.2016.,）,rAAV的应用-神经示踪利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触,19,
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